ICS 07. 100.30 53 GE 中华人民共和国国家标准 GB/T 22429—2008 食品中沙门氏菌、 肠出血性大肠埃希氏菌0157及 单核细胞增生李斯特氏菌的 快速筛选检验 酶联免疫法 Rapid screening for Salmonella, Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes in foods- Enzyme-linked immunoassay method 2009-02-01实施 2008-10-19发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 22429—2008 前言 本标准的附录A为资料性附录。 本标准由全国食品工业标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：杭州市质量技术监督检测院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海食品 药品检验所。 本标准主要起草人：肖海龙、顾鸣、芮昶、韩伟、徐伟东、鲍英、王颖 1 GB/T22429—2008 食品中沙门氏菌、 肠出血性大肠埃希氏菌0157及 单核细胞增生李斯特氏菌的 快速筛选检验酶联免疫法 1范围 本标准规定了食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的酶联 免疫法的检验步骤和判断原则。 本标准适用于各种食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的 定性检验。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 GB/T4789.6食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 GB/T4789.30食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 3方法提要 样品作增菌处理，增菌液经加热处理后移人包被特异性抗体（一抗）的固相容器内，使目标菌与一抗 结合，洗去未结合的其他成分；加人特异性酶标抗体（二抗），再次洗去未结合的其他成分；加人特定底物 与之反应，生成荧光化合物或有色化合物，通过检测荧光强度或吸光度，与参照值比较，得出检验结果。 4设备和材料 4.1 酶联免疫分析仪（VIDAS仪或类似产品"）。 4.2冰箱：2℃~8℃。 4.3恒温培养箱：30℃±1℃,36℃±1℃，42℃±1℃。 4.4均质器。 4.5电子天平：量程0g~500g，感量0.1g。 4.6旋涡混合器。 4.7恒温水浴锅。 4.8灭菌设备。 5培养基、试剂和试剂盒 5.1缓冲蛋白陈水（BP）：按GB/T4789.28—2003中4.12的规定配制。 1）VIDAS仪是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对 该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 1 GB/T22429—2008 5.2 氯化镁孔雀绿增菌液（MM)：按GB/T4789.28一2003中4.13的规定配制 5. 3 四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）：按GB/T4789.28—2003中4.14的规定配制。 5.4 亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC)：按GB/T4789.28—2003中4.16的规定配制。 5.5改良肠道菌新生霉素增菌液（mEC十n）：制法参见第A.1章。 5.6FraserI增菌液：制法参见A.2.2.5。 5.7 FraserⅡ增菌液：制法参见A.2.2.6。 5.8 盐酸吖啶黄溶液：制法参见A.2.2.1。 5.9萘啶酮酸钠盐溶液：制法参见A.2.2.2。 5.10 沙门氏菌酶联免疫试剂盒。 5.11 肠出血性大肠埃希氏菌O157酶联免疫试剂盒。 5.12单核细胞增生李斯特氏菌酶联免疫试剂盒 6检验 6.1沙门氏菌的检验 6.1.1前增菌和增菌：按GB/T4789.4中的规定处理。 6.1.2增菌后处理：移取1mL增菌液到灭菌小试管中，于沸水中加热15min。剩余的增菌液于4℃ 保存，以便用于阳性确认 6.1.3取沙门氏菌的酶联免疫试剂盒，于15℃～30℃的环境中放置30min。 6.1.4取适量加热处理后的增菌液到试剂盒测试孔中，通过自动或手动操作，经过酶联免疫反应过程 后，检测反应强度（荧光强度或吸光度），与参照值比较，得出检验结果。 注：详细操作需根据所用仪器及试剂盒的说明进行。 6.2肠出血性大肠埃希氏菌0157的检验 6.2.1增菌：无菌操作取25g（mL）样品到均质袋中，并向其中加人225mLmEC十n，充分均质，于 41℃±1℃培养24h±1h。 6.2.2增菌后处理：按6.1.2给出的步骤处理。 6.2.3取肠出血性大肠埃希氏菌0157的酶联免疫试剂盒，于15℃～30℃的环境中放置30min。 6.2.4检验步骤按6.1.4给出的步骤处理。 6.3单核细胞增生李斯特氏菌的检验 6.3.1前增菌：无菌操作取25g（mL)样品到均质袋中，并向其中加人225mLFraserI增菌液，充分均 质，于30℃±1℃培养24h±1h。 SAC 24 h±1 h。 6.3.3增菌后处理：按6.1.2给出的步骤处理。 6.3.4取单核细胞增生李斯特氏菌的酶联免疫试剂盒，于15℃～30℃的环境中放置30min。 6.3.5检验步骤按6.1.4给出的步骤处理。 7试剂盒控制 7.1选用新批号试剂盒时，应验证试剂盒的质量指标；使用时应严格按照试剂盒的要求设立试验对照。 7.2选用试剂盒检验不同目标菌期间，应不定期选用相应的可溯源标准菌株进行过程控制。 8结果报告 检验结果为阴性时，报告为未检出。检验结果为阳性时，应按GB/T4789.4、GB/T4789.6、 GB/T4789.30或其他标准进行确证。 2 GB/T22429—2008 附录A （资料性附录） 培养基 A.1改良肠道菌新生霉素增菌液（mEC+n） A.1.1成分 胰蛋白陈 20.0 g 3号胆盐 1. 12 g 乳糖 5.0 g 无水磷酸氢二钾 4.0 g 1.5 g 无水磷酸二氢钾 氯化钠 5.0 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2制法 将上述成分溶于水后校正pH至6.9士1，分装后置121℃高压灭菌15min，取出后冷却至室温，加 人过滤的新生霉素溶液，使其终浓度为20mg/L。 A.2 Fraser增菌液 A.2.1成分 5.0 g 酪蛋白酶消化物 动物组织酶消化物 5.0 g 牛肉浸膏 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 氯化钠 20.0 g 磷酸氢二钠 12. 0 g 磷酸氢二钾 1.35 g 七叶苷 1.0 g 氯化锂 3. 0 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2制法 将上述成分置于50℃水浴中充分溶解，冷却后调pH至7.0～7.4，分装，121℃灭菌15min。 A.2.2.1盐酸吖啶黄溶液 盐酸吖啶黄 25 mg 灭菌蒸馏水 10 mL 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌，避光保存。 A.2.2.2萘啶酮酸钠盐溶液 萘啶酮酸 20 mg 0.05mol/L氢氧化钠溶液 10 mL 振摇混匀，充分溶解后过滤除菌。 A.2.2.30.05mol/L氢氧化钠溶液 氢氧化钠 0.1 g