ICS65.080 CCSB13 GXAF 团 体 标 准 T/GXAF0014—2023 含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥生产 技术规程 Technicalcodeofpracticefortheproductionofbio-organicfertilizer containingBacillusvelezensis 2023-06-28发布 2023-07-01实施 广西肥料协会  发布 全国团体标准信息平台 T/GXAF0014—2023 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西多得乐生物科技有限公司提出。 本文件由广西肥料协会归口。 本文件起草单位：广西多得乐生物科技有限公司、广西鼎乐生物科技有限公司、广西鼎好实验室仪 器设备有限公司、广西植保科技有限公司、广西启迪农林发展有限公司、广西桂农联农业发展有限公司、 广西鸿生源环保股份有限公司。 本文件主要起草人：江朝明、姜明国、杨齐、陆富海、黄斌良、蓝呈、邓桂平、覃鹏志、吴科谋、 黄品忠、韦子安、陈斌艳、盘来生、陈伟雄、班大金、廖君、卢一叶、陆章权、李辉宁。 全国团体标准信息平台 T/GXAF0014—2023 2含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥生产技术规程 1范围 本文件界定了含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥生产涉及的术语和定义，规定了生产条件、原料、生产 工艺流程等技术要求，给出了菌种发酵、有机料腐熟、混合等阶段的操作指示。 本文件适用于含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥的生产。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB3095环境空气质量标准 GB5749生活饮用水卫生标准 NY/T525有机肥料 NY/T798—2015复合微生物肥料 NY884—2012生物有机肥 NY/T1109微生物肥料生物安全通用技术准则 HJ1088排污单位自行监测技术指南磷肥、钾肥、复混肥料、有机肥料和微生物肥料 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物有机肥Bio-organicfertilizer 特定功能微生物与主要以动植物残体（如畜禽粪便、农作物秸秆等）为来源并经无害化处理、腐熟 的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。 [来源：NY884—2012] 3.2 贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis 是一种新命名的生防菌，已被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体，该菌属厚壁菌门，芽孢杆菌目， 芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，具有抗菌谱广、生长迅速、易分离培养、 抗逆性强和生物安全性高等优点。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DO：溶氧度（DissolvedOxygen）。 OD660：在660nm波长下的光密度（opticaldensity）。 5生产条件 5.1生产环境 5.1.1生产厂区不应建立在城市和城镇居民区、生活饮用水源保护区、风景名胜区、自然保护区，以 及国家或地方法律、法规要求需要特殊保护的区域。 5.1.2生产厂区环境的空气质量应符合GB3095中二类区的规定，生产用水应符合GB5749的要求。 生产企业在生产运行期间，应按照HJ1088的要求对其水、气污染物，噪声及对周边环境质量进行监测 全国团体标准信息平台 T/GXAF0014—2023 3并达到相关技术要求。 5.2生产场地 生产场地包括原料存放区、有机物腐熟区、菌种培养区、混合区、成品存放区。各区域隔离分区, 防止交叉污染；原料存放区应防火、防雨、防水、防潮；成品存放区应干燥、通风、防晒、防破裂、防 雨淋。 5.3仪器设备 包括但不限于超净台、灭菌锅、摇床培养箱、生化培养箱、种子罐、发酵罐、空气压缩机、菌液储 存罐、蒸汽发生器、翻堆机、搅拌机、分光光度计、生物显微镜。 6原料要求 6.1菌种 贝莱斯芽孢杆菌菌种来源明确，菌株安全性应符合NY/T1109的规定。 6.2腐熟有机料 腐熟有机料应符合NY/T525的规定。 6.3培养基原料 6.3.1蛋白胨：生化试剂，氮含量≥7％。 6.3.2琼脂：生化试剂，含量≥99％。 6.3.3酵母提取物：生化试剂，氮含量≥5％。 6.3.4葡萄糖：工业级，含量≥95％。 6.3.5氯化钠：化学纯，ρ=2.165 g/cm³，含量≥99.5％。 6.3.6磷酸二氢钾：化学纯，ρ=2.338 g/cm³，含量≥99％。 6.3.7七水硫酸镁：化学纯，ρ=1.68 g/cm³，含量≥99.5％。 6.3.8碳酸钙：化学纯，ρ=2.93 g/cm³，含量≥98％。 7生产工艺流程 含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥的生产工艺流程见图1。 图1含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥生产工艺流程 8生产方法 全国团体标准信息平台 T/GXAF0014—2023 48.1贝莱斯芽孢杆菌培养 8.1.1种子斜面 培养基经灭菌，冷却后待用。种子斜面在37 ℃下培养24 h～48 h，放于冰箱4 ℃保藏待用。培养基 配方参见附录A。 8.1.2一级摇瓶培养 培养基经灭菌，冷却后待用。在无菌条件下用接种环从种子斜面挑取一环菌苔到一级摇瓶培养基， 在37 ℃下培养12 h～24 h，OD660≥1.0。培养基配方参见附录A。 8.1.3二级摇瓶培养 培养基经灭菌，冷却后待用。在无菌条件下将一级种子接到二级摇瓶培养基，接种量3％～5％，在 37 ℃下培养10 h～24 h，OD660≥1.5。培养基配方参见附录A。 8.1.4种子罐培养 培养基经灭菌，经冷却，调pH6.5～7.5后待用。在无菌操作条件下将二级种子接入种子罐培养， 接种量3％～5％，通过调节转速、空气流量、罐压确保DO≥50％，取样检测OD660≥5.0，可移种到发酵 罐。培养基配方参见附录A。 8.1.5发酵罐培养 8.1.5.1培养基经灭菌，经冷却，调pH6.5～7.5后待用，培养基配方参见附录A； 8.1.5.2种子液移进发酵罐，接种量3％～5％，温度37±5 ℃，当pH下降至6.5以下，开始补碱， 将pH控制在6.5～7.5； 8.1.5.3通过调节转速、空气流量、罐压确保DO≥50％； 8.1.5.4当罐内泡沫上升即将逃料时，进行消泡处理。 8.1.6补料 培养4 h后开始取样检测糖盐度及OD660，当糖盐度下降至小于1.5％时，通过补加浓度为35％～45％ 的葡萄糖溶液，使糖盐度维持在1.5％～2.5％。 8.1.7放罐 当OD660不再增加，检测芽孢率≥80％时，放罐，培养结束。 8.1.8菌液贮存 菌液经检测有效活菌数后置于贮存罐保存待用。 8.2混合 根据菌液的有效活菌数，通过混合装置将腐熟有机料与菌液混合并过筛。 8.2.1计量包装 含贝莱斯芽孢杆菌生物有机肥应按包装的产品规格要求进行计量，包装及标识应符合NY/T798— 2015中7.1～7.2的规定。 8.2.2质量检验 按NY884规定的抽样方法及试验方法对肥料样品进行抽样检验，肥料应符合NY884的规定，检测合 格后入库；检测不合格则返回8.2步骤重新混合生产。 全国团体标准信息平台 T/GXAF0014—2023 5AA 附录A （资料性） 培养基配方 培养基配方参见表A.1。 表A.1培养基配方 培养基类型 配方 种子斜面培养基 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，加水至1 L。 一级摇瓶培养基 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加水至1 L。 二级摇瓶培养基葡萄糖1.0％，酵母提取物0.5％，磷酸二氢钾0.02％，七水硫酸镁0.01％，加水至100％。 种子罐培养基葡萄糖1.0％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.02％，七水硫酸镁0.01％，消泡剂0.03％，加水至100％。 发酵罐培养基葡萄糖2.0％，酵母膏1.0％，磷酸二氢钾0.05％，七水硫酸镁0.02％，碳酸钙0.005％，消泡剂 0.03％，加水至100％。 注：消泡剂可选聚醚类、有机硅类等产品。 全国团体标准信息平台