ICS 65.150 CCS B 52 四川省 地方 标准 DB51/T 3065—2023 DB51 克氏原螯虾斑综合征诊断和防控技术规程 2023-06-19发布 2023-08-01实施 四川省市场监督管理 局 发布 DB51/T 3065 —2023 I 目次 前 言 ................................ ................................ ........... II 1 范围 ................................ ................................ ................ 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ...... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ .......... 1 4 诊断 ................................ ................................ ................ 1 5 预防 ................................ ................................ ................ 4 6 治疗 ................................ ................................ ................ 4 7 病死虾处理 ................................ ................................ .......... 4 附录A （资料性） 白斑综合征病毒基因参考序列 ................................ ........... 5 DB51/T 3065 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 四川省农业农村厅 提出、归口并解释 。 本文件起草单位： 四川农业大学 。 本文件主要起草人： 黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍 。 本文件为 首次发布 。 DB51/T 3065 —2023 1 克氏原螯虾白斑综合征诊断和防控技术规程 1 范围 本文件规定了由白斑综合征病毒 (white spot syndrome virus ，WSSV) 引起的克氏原螯虾 (Procambarus clarkii )白斑综合征的 诊断、预防、治疗及病死虾处理 等要求。 本文件适用于克氏原螯虾白斑综合征的诊断以及四川行政区域内稻田和池塘养殖克氏原螯虾白斑 综合征的防控 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 11607 渔业水质标准 GB/T 28630.2 -2012 白斑综合征 (WSD)诊断规程 第2部分：套式 PCR 检测法 NY/T 5361 无公害农产品 淡水养殖产地环境条件 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 克氏原螯虾白斑综合征 white spot syndrome of Protocrayfish clarkii 由白斑综合征病毒感染引起的克氏原螯虾发病或死亡的一种病毒性疾病。 4 诊断 4.1 试剂和材料 4.1.1 试剂 检验中所需试剂的配制按照 GB/T 28630 .2-2012和SC/T 7014 的规定执行， Taq Master Mix 、10×PCR 缓冲液 (无Mg2+)、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂。除非 另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。 4.1.2 水 应符合GB/T 6682 中一级水的规格、且用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 处理水。 4.1.3 引物 DB51/T 3065 —2023 2 外侧引物： F1: 5’-ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG -3’; R1: 5’-TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA -3’。 用来扩增 WSSV DNA 的1447bp产物，-20℃保存。 内侧引物 （套氏引物） ： F2: 5’-GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA -3’; R2：5’- TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT -3’。 用来从第一步 PCR扩增的1447bp产物中再扩增出 941bp的产物， -20℃保存。 内参引物： F3：5’-TGCCTTATCAGCTNTCGATTGTAG -3’；R3：5’-TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC -3’， 扩增十足类动物 DNA中848bp的片段产物， -20℃保存。 4.2 设备与器械 设备和器械应当符合 GB/T 28630.2 -2012的规定。 4.3 临床检查 4.3.1 临床症状 患病克氏原螯虾主要临床症状为体色变暗、摄食减少、反应迟钝、活力较差。 4.3.2 剖检 患病克氏原螯虾内脏器官大体病变不典型， 主要表现为部分肠段中空无食物， 肠壁透明， 肠管较细； 头胸甲易剥离；剥开头胸甲后部分病虾可在头胸甲与肌肉之间的膜上见到大量白色斑点。其余器官如肝 胰腺、鳃等无明显变化。 4.4 实验室样品采集 样品采集按 GB/T 28630.2 -2012 中附录B的规定执行。 4.5 DNA提取 4.5.1 样品准备 4.5.1.1 活体或冰冻的仔虾及幼虾个体样品 (去虾眼) 约0.1g；活体或冰冻的成虾鳃、心脏、肝胰腺、 肠、步足、游泳足等组织样品约 0.1g。 4.5.1.2 将上述待检样品用生理盐水洗去血污，剪碎，放入灭菌后的 1.5 mL离心管中，后用匀浆器将样 品均浆成糊状，避免各样品间的交叉污染。所有非一次性使用的样品处理工具要经清洗，然后浸于新配 制的75%酒精中5 min，无菌水充分清洗两次后，方可使用。 4.5.2 提取DNA 样品DNA提取按照 GB/T 28630.2 -2012中6.3的规定执行。 4.5.3 微量分光光度计测定核酸浓度和纯度 4.5.3.1 在上样孔处 点入1.5μL无菌水，点样时不要有气泡残留，对仪器进行校准 。 4.5.3.2 校准完成后，用擦镜纸将无菌水擦干净，之后点入 1.5μL待测样品，扣上样品盖，对待测样品 进行核酸浓度和纯度的测定 。合格的双链 DNA的A260/A280 应在1.7～1.9之间， 若比值较高说明提取的 DNA 中有RNA残留，若比值较低说明有蛋白质残留。 4.6 DNA提取质量及体系监控 使用内参引物 F3和R3，按照GB/T 28630.2 -2012中6.4的规定进行样品提取质量及反应体系监控。 4.7 套氏PCR操作 DB51/T 3065 —2023 3 4.7.1 使用外侧 引物F1和R1，按照GB/T 28630.2 -2012中6.5.1的规定进行第一步 PCR。 4.7.2 使用内侧引物 F2和R2，按照GB/T 28630.2 -2012中6.5.2的规定进行第二步 PCR。 4.8 DNA的序列测定 4.8.1 琼脂糖凝胶制作 琼脂糖凝胶的制作按照 GB/T 28630.2 -2012中6.6.1的规定执行 。 4.8.2 电泳 电泳按照 GB/T 28630.2 -2012中6.6.2的规定执行 。 4.8.3 PCR 扩增产物纯化、测序及序列比对 4.8.3.1 在长波紫外灯下用刀片切下套氏 PCR扩增后含目的条带 (约941bp)的胶块，放入无菌离心管 中称重。 4.8.3.2 按每0.1g 琼脂糖凝胶加 0.1mL酚，将酚加入 4.8.3.1含有目的条带胶块的离心管中，漩涡震荡 仪震荡 1min～2min，将离心管在 -70 ℃放置 1h，使凝胶完全冻结 。 4.8.3.3 37℃水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1min～2min；14000r/min 离心 5min， 取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚 -三氯甲烷 -异戊醇 (25:24:1) ，混匀， 12000r/min 离心 5min。 4.8.3.4 取上清液加入等体积的三氯甲烷 -异戊醇 (24:1)，混匀， 12000r/min 离心5min。 4.8.3.5 向收集的水溶液中加入 1/10体积的3mol/L的乙酸钠和 2倍体积的无水乙醇， -20℃过夜或 -70 ℃ 放置 1h～2h。