ICS 11.220 CCS B 40 黑 DB23 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3032—2021 规模化奶牛场牛白血病净化技术规程 2021-12-24 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-01-23 发布 实施 DB23/T 3038—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业农村局归口。 本文件起草单位：黑龙江八一农垦大学，东北农业大学。 本文件主要起草人：王建发、刘云、武瑞、连帅、贺显晶、王爽、宋军、孙东波、周玉龙、王海、 胡学权、谢颖颖。 Ⅰ DB23/T 3038—2021 规模化奶牛场牛白血病净化技术规程 1 范围 本文件规定了开展牛白血病净化的技术规程。 本文件适用于规模化奶牛场实施针对牛白血病的净化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB 16568 奶牛场卫生规范 NY/T 574-2002 地方流行性牛白血病琼脂凝胶免疫扩散试验方法 中国动物疫病预防控制中心 规模化奶牛场主要动物疫病净化技术指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛白血病 牛白血病是由牛白血病病毒引起的一种以淋巴细胞恶性增生，进行性恶病质变化和全身淋巴结肿 大为特征的一种慢性、进行性、接触传染性、肿瘤性疾病。 3.2 动物疫病净化 在一个养殖场或指定区域内，通过持续监测和检测发现患病动物或带毒动物，并通过淘汰带毒动 物以实现根除某种动物疫病的过程。 4 检测规程 4.1 琼脂凝胶免疫扩散试验 使用一次性无菌采血设备采集待检牛只血液，分离血清。按照NY/T 574-2002检测血清中牛白血病 病毒gp51抗原，检测结果阳性即判定为牛白血病病毒感染阳性。 4.2 酶联免疫吸附试验 无菌采集待检牛只血液，分离血清或血浆。使用符合要求的商品化试剂盒按说明检测血清或血浆 中牛白血病病毒gp51抗原或牛白血病病毒X2抗体，检测结果阳性即判定为牛白血病病毒感染阳性。 无菌采集待检泌乳牛乳汁，使用符合要求的商品化试剂盒按说明检测乳汁中牛白血病病毒抗体， 检测结果阳性即判定为牛白血病病毒感染阳性。 4.3 基因扩增试验 使用一次性无菌采血设备采集待检牛只抗凝血，使用商品化全血基因组DNA提取试剂盒按说明提 取全血中的DNA。核酸检测操作参照附录A执行，被检测样品PCR扩增产物基因序列与牛白血病病毒 囊膜基因序列同源性在95%以上，判定为牛白血病病毒感染阳性。 1 DB23/T 3038—2021 5 检测后处理 经检测为牛白血病病毒感染阳性牛不再进行饲养，淘汰阳性牛后，使用次氯酸钠、甲醛、戊二醛 等敏感消毒剂对牧场进行消毒，清除运动场、牛舍、奶厅、器械、空气中潜在的病毒风险。按照 GB16548严格执行卫生防疫制度，在奶牛保健、治疗、护理时，避免交叉感染。 6 持续检测与净化 启动净化程序后，采取检测、淘汰、消毒相结合的净化措施对奶牛场牛白血病进行持续净化。每 年进行两次全群检测，发现阳性牛的处置方式同5。 7 净化标准与维持 按照《规模化奶牛场主要动物疫病净化技术指南》采样数量要求采集奶牛血液，连续2年牛白血病 检测个体阳性率小于0.1%可列为假定阴性群。 假定阴性群无需再进行全群检测，转为按照不低于10%的比例进行抽样检测，如抽样检测不符合 个体阳性率小于0.1%要求，则按照4~6推荐的净化程序重新实施净化。 2 DB23/T 3038—2021 附 录 A （规范性附录） 电泳法检测牛白血病病毒囊膜基因核酸操作规范 A.1 引物序列 上 游 引 物 序 列 为 5’-CAACCGATCATCAGATGGGTAAG-3’ ， 下 游 引 物 序 列 为 5’CAGGGAGCATCT CCAAGTCTG-3’。 A.2 核酸扩增反应体系 25 μL 核酸扩增反应体系如下：双蒸水 18.3 μL，待测 DNA 样品 1.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引 物 0.5 μL，耐热缓冲液 2.5 μL，2. 5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，耐热 DNA 聚合酶 0.2 μL。 A.3 核酸扩增反应条件 94℃预变性 5 min；94℃变性 60 s，60℃退火 60 s,72 ℃延伸 30 s，循环 35 次；72℃延伸 6 min。 A.4 电泳检测 制备 2.5%琼脂糖凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取 5.0 μL 扩增产物 分别和适量加样缓冲液混合后，加到凝胶孔。110 V 恒压电泳 30 min，使用凝胶成像系统检测核酸扩 增结果。 A.5 判定标准 被检测样品 PCR 扩增产物出现 79 bp 特异性目的条带，取扩增产物进行测序，与牛白血病病毒囊 膜基因序列同源性在 95%以上，判定该牛患有牛白血病。 3