(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211321165.X (22)申请日 2022.10.26 (71)申请人 云南省烟草农业科 学研究院 地址 650000 云南省昆明市圆通 街33号 (72)发明人 方敦煌　 (74)专利代理 机构 成都市鼎宏恒业知识产权代 理事务所(特殊普通合伙) 51248 专利代理师 吴佳洁 (51)Int.Cl. A01G 22/45(2018.01) A01G 7/06(2006.01) G06Q 10/06(2012.01) G06Q 50/02(2012.01) C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病 抗性鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了一种改进的全生育期人工病 圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 包括病田寻 访、 布局诱发诊 查、 补接与诱发建立成熟病圃、 病 害调查评价抗性等4个步骤， 本发明不需要先建 立成熟病圃、 再开展品种抗性鉴定， 采用的病圃 直接来源自然的零星发病田， 在病田采用M垄2行 纵横布局、 均匀种植感病品种， 作为病害指示植 株， 覆膜、 滴灌造就了易于发病的温湿度条件， 建 立零星发病的病圃， 再通过定向补接、 补救接种 均一化病圃， 病圃经过或不经过条块状病圃、 最 终发展为成熟病圃， 建立 成熟病圃的同时完成品 种的抗病性鉴定， 缩短了建立成熟病圃2 ‑3年的 时间， 提高了烟草青枯病病圃抗性鉴定的时效性 和规模化。 权利要求书3页 说明书9页 附图1页 CN 115530037 A 2022.12.30 CN 115530037 A 1.一种改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其特征在于： 包括病 田寻访、 布局诱发诊查、 补接与诱发建立成熟病圃、 病害调查评价 抗性4个步骤， 具体包括： (A)病田寻访： 明确往年植烟区烟草青枯病的发生与分布情况， 选择交通便利的代表烟 区， 选取地势平坦、 土壤质地和肥力均匀、 排灌通畅、 田块方正的发病地块作为病圃， 并取土 采用半选择性培 养基分离病菌验证； (B)布局诱发诊查： 布局， 根据步骤(A)寻访获得病圃田块的大小、 供试品种的多少设置 3‑4个重复， 田块四周以及重复间相隔的纵垄种植感病对照品种， 每重复横垄种植供试品 种， 每20‑30个供试品种中设置1个感病对照或辅助 感病对照， 3 ‑4个重复叠加在一起、 感病 对照和辅助感病对照品种均匀地分布在横垄中， 纵垄与横垄均为M型、 植烟2行、 行距70 ‑ 80cm、 株距3 5‑45cm， 相邻纵垄与横垄的间距与横垄的间距相同均为90 ‑100cm； 植烟后， 覆盖黑色地膜增温、 地插式滴灌维持土壤水饱和保湿方式诱发病害， 每10天观 察田间均匀分布的感病对照或辅助感病对照品种青枯病的发生情况， 当发现局部有青枯病 初期症状时， 病圃具 备发病的条件， 为 零星发病 病圃； (C)补接与诱发建立成熟病圃： 根据步骤(B)布局种植烟株功能根的伸展幅度， 调节切 根铲与烟株的距离和插切根际土壤的深度， 沿垄两端创伤根系， 顺切根点定株浇灌6.0 ‑ 30.0×108cfu/mL的烟草青枯病菌悬浮液100 ‑200mL补接1次或补救接种1 ‑3次， 接种后， 覆 盖或不覆盖黑色地膜、 地插式滴灌维持土壤水饱和保湿诱 发病害， 每10天观 察、 调查田间均 匀分布的感病对照或辅助感病对照青枯病发生情况， 直至田间均匀分布的感病对照或辅助 感病对照由条块状发生青枯病到发病均匀、 发病率80％以上或直接由零星发病到发病均 匀、 发病率80％以上为止， 即病圃从零星发病的病圃经过或不经过条块状病圃最终发展为 发病均匀、 发病率80％的成熟病圃； (D)病害调查评价抗性： 发现步骤(C)建立的病圃成熟时的当天或次日及其后每10天， 按病害严重度调查记录病情， 每次调查完成后计算病情指数， 当感病对照 或辅助感病对照 的病情指数不低于60时停止调查， 以时间间隔与病 情指数计算病害曲线下面积AUDPC和病程 相对抗性指数RRICD， 基于不同抗 性水平的参照品种数值范围划定抗 性水平。 2.根据权利要求1所述的改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其 特征在于： 所述步骤(A)的病田为单一病害的发病地块， 即只发生烟草青枯病的田块、 没有 其他混发的根、 茎基部病害； 所述取土采用30 ‑40m2分割、 五点取样、 每点取500g深度为20cm耕作层土壤、 混匀作为1 个土壤样品； 所述半选择性培养基配方为蛋白胨10g、 甘油5mL、 酪蛋白水解氨基酸1g、 琼脂粉15g、 蒸 馏水1 000mL， 半选择性培养基121℃灭菌20min后， 待降到50℃后再添加100 μg/mL多粘菌素 B、 5 μg/mL结晶紫、 50 μg/mL氯化三苯基四氮唑(TTC)、 2 5 μg/mL杆菌肽、 0.5 μg/mL青霉素、 5 μg/ mL氯霉素和10 0 μg/mL放线菌酮； 所述分离病菌采用土壤稀释涂平板法进行。 3.根据权利要求1所述的改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其 特征在于： 所述 步骤(B)品种或对照品种每重复至少16株， 等分1垄2行种植。 4.根据权利要求1所述的改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其 特征在于： 所述步骤(C)烟株功能根为白色、 未木栓化 或未木质化的幼嫩侧根， 具有吸收、 分权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115530037 A 2泌、 输导、 合成、 繁殖多种生理功能； 所述切根铲为直刀铲， 宽5 ‑8cm、 长15 ‑25cm， 铲尖有刀 锋、 外缘齿状， 铲上端带有可调节、 固定的脚踩板， 可根据密集功能根的深浅进行调整、 固 定， 铲柄末下段有10 ‑25cm可调定位杆， 根据烟株密集功能根根系生长的宽度以根茎部和铲 柄为两端点调节 距离、 固定； 所述烟草青枯病菌悬浮液采用分离、 保存的青枯病菌在含有50 μg/mL  TTC的CPG培养基 上28℃培养48h活化1 ‑2次， 挑取典型青枯单菌落用青枯病检测试纸条测 定为阳性后， 再在 无TTC的CPG培养基平板上高密度划线扩繁， 将 菌苔刮下， 灭菌水调节青枯病菌浓度， 青枯菌 浓度以OD600快速计测、 稀释涂布于无TTC的CPG培养基平板上计数验证， 浓度与剂量根据烟 株的生长期确定， 生长期越长， 浓度与剂量越大； 所述补接或补救接种时仅接种无初期病害症状的烟株； 所述发病率 为发病株数占总株数的百分比。 5.根据权利要求1所述的改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其 特征在于： 所述 步骤(D)病害严重度， 分级方法为： 0级： 全株无病； 1级： 茎部偶有褪绿斑， 或病侧1/2以下叶片凋萎； 3级： 茎部有黑色条斑， 但不超过茎高1/2， 或病侧1/2 ～2/3叶片凋萎； 5级： 茎部黑色条斑超过茎高1/2， 但未到 达茎顶部， 或病侧2/ 3以上叶片凋萎； 7级： 茎部黑色条斑到 达茎顶部， 或病株叶片全部凋萎； 9级： 病株 基本枯死； 病情指数(DI)， 采用如下公式计算： 其中， i： 病情级数(0 ‑9)； xi： i级植株 株数； 感病对照品种病情指数至少有1次调查时不低于60， 烟草青枯病抗性鉴定有效， 否则为 无效。 6.根据权利要求1所述的改进的全生育期人工病圃烟草品种青枯病抗性鉴定方法， 其 特征在于： 所述 步骤(D)病害曲线下面积AUDPC公式如下： 其中， yi为第i次记载的病情指数， 包括初始病害调查， 该次的病情指数为病圃成熟时当 天或次日的调查结果， 默认为第 1次， 往后顺延， yi+1为第i+1次记载 的病情指数， ti+1－ti为 第i+1次与第i次记载的间隔时间天(d)； 病程相对抗性指数RRICD＝100×(AUDPCCK—AUDPCT)/AUDPCCK， 式中AUDPCCK为感病对照品种病 害曲线下面积， AUDPCT为测试品种 病害曲线下面积； 基于不同抗性水平参照品种数值范围划定抗性水平， 分为5个等级： 免疫(I)： RRICD 100； 抗(R)： RRICD 30.1‑99.9； 中抗(MR)： RRICD 20.1‑30.0； 中感(MS)： RRICD 10.1‑20.0； 感(S)： RRICD 10.0及以下， 含负数。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115530037 A 3