(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210530460.X (22)申请日 2022.05.16 (66)本国优先权数据 202210465466.3 2022.04.29 CN (71)申请人 深圳大学 地址 518060 广东省深圳市南 山区粤海街 道南海大道3 688号 (72)发明人 严伟　黄仰锐　王璐玮　郭勇　 高欣慰　罗腾　屈军乐　 (74)专利代理 机构 深圳市恒申知识产权事务所 (普通合伙) 44312 专利代理师 钟连发 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/01(2006.01) (54)发明名称 一种双光子荧 光多色成像系统及方法 (57)摘要 本发明提供了一种双光子荧光多色成像系 统及方法， 包括激光组件、 双色镜、 采集组件、 载 物台、 滤波器、 光电倍增管以及成像装置， 激光组 件与双色镜之间具有第一光路， 双色镜与载物台 之间具有第二光路， 采集组件设置于第二光路 上， 双色镜与成像装置之间具有第三光路， 第三 光路自双色镜依次经过滤波器、 光电倍增管至成 像装置； 激光组件， 用于产生激发光； 双色镜， 用 于透射激发光， 反射荧光信号； 滤波器， 用于透过 特定波长范围的荧光信号， 滤除杂散光信号； 成 像装置， 用于数据交换， 并对数据进行处理生成 图像。 本发 明利用单激发波长实现双光子的多色 成像， 能够有效简化 光路复杂性和造价成本 。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 114965399 A 2022.08.30 CN 114965399 A 1.一种双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 包括激光组件、 双 色镜、 采集组件、 载物 台、 滤波器、 光电倍增管以及成像装置， 所述激光组件与所述双色镜之间具有第一光路， 所 述双色镜与所述载物台之间具有第二光路， 所述采集组件设置于所述第二光路上， 所述双 色镜与所述成像装置之间具有第三光路， 所述第三光路自所述双色镜依次经过所述滤波 器、 所述光电倍增管至所述成像装置； 其中， 所述激光组件， 用于产生激发光； 所述双色镜， 用于 透射激发光， 反射 荧光信号； 所述采集组件， 用于采集所述载物台上的样品的荧 光信号； 所述载物台， 用于放置和固定样品， 调节样品三维空间位置； 所述滤波器， 用于 透过特定波长范围的荧 光信号， 滤除杂散光信号； 所述光电倍增管， 用于 探测和收集荧光信号， 进行光电转换和信号增强； 所述成像装置， 用于数据交换， 并对数据进行处 理生成图像。 2.如权利要求1所述的双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 所述激光组件包括激光 发射源、 第一准直透镜、 第二准直透镜、 第一透镜与第二透镜， 所述第一光路自所述激光发 射源依次经过所述第一准直透镜、 所述第二准直透镜、 所述第一透镜、 所述第二透镜至所述 双色镜； 其中， 所述激光发射源， 用于产生激发光； 所述第一 准直透镜、 所述第二 准直透镜， 用于光纤耦合时对激发光束 进行聚焦和扩束； 所述第一透 镜、 所述第二透 镜， 用于聚焦和准 直激光光斑。 3.如权利要求2所述的双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 所述第 一准直透镜与 所 述第二准直透镜之间具有单模光纤。 4.如权利要求1所述的双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 所述采集组件包括扫描 振镜、 扫描透镜、 管镜、 显微物镜， 所述第二光路自所述双色镜依次经过所述扫描振镜、 所述 扫描透镜、 所述管镜、 所述显微物镜 至所述载物台； 其中， 所述扫描振镜， 用于对样品进行二维扫描； 所述扫描透 镜， 用于聚焦激发光束； 所述管镜， 用于对激发光束 进行扩束， 适配显微物镜的通 光孔径； 所述显微物镜， 用于聚焦空间上重 叠的激发光， 同时收集样品反射回来的荧 光信号。 5.如权利要求1所述的双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 所述滤波器与 所述光电 倍增管之间具有第三透 镜。 6.如权利要求1所述的双光子荧光多色成像系统， 其特征在于， 所述成像装置包括数据 采集卡与成像模块， 所述数据采集卡一端与所述光电倍增管通信连接， 所述数据采集卡另 一端与所述成像模块 通信连接 。 7.一种双光子荧光多色成像方法， 其特征在于， 应用于如权利要求1 ‑6中任意一项所述 的双光子荧 光多色成像系统， 所述方法包括： 对细胞的不同结构进染色标记， 并利用同种波长的激发光对所述标记进行双光子激 发， 并获得荧 光信号； 对所述荧光信号进行滤波处理得到第一图像信号、 第二图像信号以及第三图像信号， 并对所述第一图像信号、 所述第二图像信号以及所述第三图像信号进 行图像相减处理得到权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114965399 A 2第一荧光信号、 第二 荧光信号与第三 荧光信号； 将得到的所述第 一荧光信号、 所述第 二荧光信号与所述第 三荧光信号使用图像重建得 到三色荧 光图像。 8.如权利要求7所述的双光子荧光多色成像方法， 其特征在于， 所述图像相减包括： IGREEN＝IB‑α IDAPI， IORANGE＝IC‑β IB； 其中， IDAPI为第一图像信号的信号强度， IB为第二图像信号 的信号强度， IC为第三图像信号的信号强度， IDAPI为第一荧光信号的信号强度， IGREEN为第二 荧光信号的信号强度， IORANGE为第三荧光信号的信号强度， α 和β 为差异系数； α ＝∑EB( λ )/∑EA( λ )， β ＝∑EC( λ )/∑EB( λ )， 其中E为发射系数。 9.如权利要求8所述的双光子荧光多色成像方法， 其特征在于， 所述对所述荧光信号进 行滤波处理得到第一图像信号、 第二图像信号以及第三图像信号， 并对所述第一图像信号、 所述第二图像信号以及所述第三图像信号进 行图像相减处理得到第一荧光信号、 第二荧光 信号与第三 荧光信号包括： 通过第一次滤波处理得到第 一图像信号， 所述第 一图像信号只包含了标记细胞核结构 信息的的第一荧光信号； 通过第二次滤波处理得到第二图像信号， 并对所述第一图像信号、 所述第二图像信号 进行图像相减处 理得到包 含了标记微管 结构信息的第二 荧光信号； 通过第三次滤波处理得到第 三图像信号， 并对所述第 二图像信号以及所述第 三图像信 号进行图像相减处 理得到包 含了标记高尔基 体结构信息的第三 荧光信号。 10.如权利要求7所述的双光子荧光多色成像方法， 其特征在于， 所述将得到的所述第 一荧光信号、 所述第二荧光信号与所述第三荧光信号使用图像重建得到三色荧光图像包 括： 通过图像重建的方法将微管结构和细胞核结构进行叠加， 得到以不同颜色进行形态结 构和空间位置区分的双色荧 光图像； 使用图像重建的方法将高尔基体结构与 所述双色荧光图像进行叠加， 得到以不同颜色 进行形态结构和空间位置区分的三色荧 光图像。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114965399 A 3