(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210855391.X (22)申请日 2022.07.19 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO: M 202 2946 2022.06.23 CCTCC NO: M 202 2947 2022.06.23 (71)申请人 济南大学 地址 250000 山东省济南市 市中区南 辛庄 西路336号 (72)发明人 李强　梁博雅　王芳　刘文举　 张国宝　吕姝颖　樊祥宇　古鹏飞　 黄兆松　 (74)专利代理 机构 山东竹森智壤知识产权代理 有限公司 37382 专利代理师 刘文容(51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12P 39/00(2006.01) C12P 7/625(2022.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的 方法 (57)摘要 本发明涉及一种双菌混合培养合成聚羟基 脂肪酸酯 的方法， 属于微生物合成技术领域。 本 发明筛选出两株菌， 分别为缺陷短波单胞菌 (Brevundimonasdiminuta)R79和巴利阿里假单 胞菌(Pseudomonas  balearica)R90。 本发明以湿 重比1:(0.5～2)将上述两株菌混合培养， 在发酵 过程中以乙酸钠为唯一碳源合成PHA， 缺陷短波 单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90之间协同增 效， 共同促进PHA产量的提高， 与现有技术相比， 提高了PHA的产量， 降低了生产成本 。 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 CN 115322924 A 2022.11.11 CN 115322924 A 1.缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79， 于2022年6月23日保藏于中国典型 培养物保藏中心， 保藏地址： 湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学， 保藏编号： CCTCC  NO: M2022946。 2.巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas  balearica)R90， 于2022年6月23日保藏于中国典 型培养物保藏中心， 保藏地址： 湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学， 保藏编号： CCTCC  NO: M 2022947。 3.权利要求1所述的缺陷短波单胞菌R79和权利要求2所述的巴利阿里假单胞菌R90中 的一种或其组合在合成聚羟基脂肪酸酯中的应用。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述应用是取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿 里假单胞菌R90中的一种或两种以乙酸钠为底 物发酵生产聚羟基脂肪酸酯。 5.权利要求1所述的缺陷短波单胞菌R79合成聚羟基脂肪酸酯的方法， 其特征在于， 步 骤如下： (1)菌种活化： 取缺陷短波单胞菌R79， 在LB固体培养基中划线， 28～30℃培养， 得到活 化菌种； (2)种子液培养： 将步骤(1)活化的缺 陷短波单胞菌R79， 挑取单菌落接种到LB 液体培养 基中， 28～3 0℃、 180～ 200rpm培养至对数生长后期， 得种子液； (3)接种培养： 将步骤(2)所得缺陷短波单胞菌R79的种子液离心去上清， 收集菌体， 将 缺陷短波单胞菌R79接种至驯化培养液中， 接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～ 25g/L， 28～3 0℃、 180～ 200rpm培养5～10d。 6.权利要求2所述的巴利阿里假单胞菌R90合成聚羟基脂肪酸酯的方法， 其特征在于， 步骤如下： (1)菌种活化： 取巴利阿里假单胞菌R90， 在LB固体培养基中划线， 28～30℃培养， 得到 活化菌种； (2)种子液培养： 将步骤(1)活化的巴利阿里假单胞菌R90， 挑取单菌落接种到LB 液体培 养基中， 28～3 0℃、 180～ 200rpm培养至对数生长后期， 得种子液； (3)接种培养： 将步骤(2)所得巴利阿里假单胞菌R90的种子液离心去上清， 收集菌体， 将巴利阿里假单胞菌R90接种至驯化培养液中， 接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15 ～25g/L， 28～3 0℃、 180～ 200rpm培养5～10d。 7.权利要求1所述的缺陷短波单胞菌R79和权利要求2所述的巴利阿里假单胞菌R90双 菌混合培 养合成聚羟基脂肪酸酯的方法， 其特 征在于， 步骤如下： (1)菌种活化： 取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90， 在LB固体培养基中划 线， 28～3 0℃培养， 得到活化菌种； (2)种子液培养： 将步骤(1)活化的缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90， 挑取 单菌落接种到LB液体培 养基中， 28～3 0℃、 180～ 200rpm培养至对数生长后期， 得种子液； (3)接种培养： 将步骤(2)所得缺 陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90的种子液离 心去上清， 收集菌体， 将缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以湿重比1:(0.5～2) 共同接种至驯化培养液中， 接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L， 28～30℃、 180～200rpm培养5～10d。 8.如权利要求5、 6或7所述的方法， 其特征在于， 所述驯化培养 液的组分为： CH3COONa5g/权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115322924 A 2L， (NH4)2SO40.16g/L， K2HPO4·3H2O 0.121g/L， KH2PO40.045g/L， NaCl16g/L， 微量元素1mL/L， pH 7.0； 其中， 所述微量元素 的组成为： MnSO4·H2O 1.5g/L， H3BO3 1.0g/L， EDTA ‑2Na 1.0g/L， CuSO4·5H2O 0.2g/L， CoCl2·6H2O 0.2g/L， ZnSO4·7H2O 0.2g/L， Na2SiO3·9H2O 0.2g/L， NaMoO4·2H2O 0.05g/L， NiSO4·6H2O0.05 g/L。 9.如权利要求5、 6或7 所述的方法， 其特 征在于， 所述离心为5 000rpm离心5～10mi n。 10.如权利 要求5、 6或7所述的方法， 其特征在于， 在接种培养的过程中， 每隔24h进行换 液， 将培养液离心， 弃去一半体积上清， 补加相同体积新鲜的驯化培养液， 继续28～30℃、 180～200rpm振荡培 养。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115322924 A 3