(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210678702.X (22)申请日 2022.06.15 (66)本国优先权数据 202210542728.1 202 2.05.18 CN (71)申请人 南昌大学第一附属医院 地址 330000 江西省南昌市永外正 街17号 (72)发明人 许恒毅　刘洋　徐倩　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/085(2006.01) (54)发明名称 一种磁分离富 集蜡样芽胞 杆菌的方法 (57)摘要 本发明公开了一种磁分离富集蜡样芽胞杆 菌的方法， 属于生物技术领域。 本发明方法包括 磁性纳米粒子与链霉亲和素的偶联， 羧酸 ‑聚乙 二醇‑生物素与头孢吡肟的偶联， 头孢吡肟 ‑羧 酸‑聚乙二醇 ‑生物素与样品液中的蜡样芽孢杆 菌共孵育并结合在菌体表面， 链霉亲和素修饰的 磁性纳米粒子与样品液中的蜡样芽胞杆菌～头 孢吡肟‑羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素结合， 在外加磁 场的作用下， 将捕获的蜡样芽孢杆菌与样品液进 行分离及重悬等步骤。 通过磁分离捕获到的蜡样 芽孢杆菌 可以直接进行后续分析； 与传统的细菌 磁分离方法相比， 该方法不仅提高了样品中蜡样 芽孢杆菌分离效率， 同时也降低了成本 。 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 CN 115058359 A 2022.09.16 CN 115058359 A 1.一种磁分离富 集蜡样芽胞 杆菌的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)活化磁性纳米粒子与链霉亲和素进行偶联， 得链霉亲和素 ‑磁性纳米粒子复合物溶 液， 记为溶 液A； (2)盐酸头孢吡肟与 羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素进行偶联， 得头孢吡肟 ‑羧酸‑聚乙二醇 ‑生 物素复合物溶 液， 记为溶 液B； (3)将待测样品溶液加入溶液B中， 共孵育， 得蜡样芽孢杆菌 ‑头孢吡肟 ‑羧酸‑聚乙二 醇‑生物素复合物溶 液， 记为溶 液C； (4)将溶液A加入溶液C中， 共孵育， 得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟 ‑羧酸‑聚乙二醇 ‑生物 素～链霉亲和素 ‑磁性纳米粒子复合物溶液， 记为溶液D； 溶液D在外加磁场的作用下， 将蜡 样芽孢杆菌与样品溶液实现分离， 得蜡样芽胞杆菌～头孢 吡肟‑羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素～ 链霉亲和素 ‑磁性纳米粒子复合物。 2.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(1)所述 活化磁性纳米粒子的表面修饰有羧基， 其粒径为180nm； 所述链霉亲和素的分子量为58KD； 所述活化磁性纳米粒子与链霉亲和素的质量比为25∶2； 步骤(1)所述偶联的方法为： 将链霉亲和素加入活化磁性纳米粒子溶液中， 置于混匀仪 上20～25℃反应2h， 加入终浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液， 20～25℃孵育45min， 孵育完 成后用PBS溶 液洗涤三次， 重悬于PBS溶 液中， 得链霉亲和素 ‑磁性纳米粒子复合物溶 液。 3.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(1)所述 活化磁性纳米粒子的制备 方法为： 将磁性纳米粒子用PBS溶 液洗涤后重悬于新的PBS溶 液中， 得磁性纳米粒子溶 液； 将EDC和NHSS分别溶解于PBS溶液中， 得EDC溶液和 NHSS溶液， 然后将EDC溶液和 NHSS溶 液加入磁性纳米粒子溶液中， 20～25℃下活化1h， 再依次用PBS溶液洗涤并重悬； 所述磁性 纳米粒子、 EDC、 NHS S的质量比为10 00∶290∶ 325。 4.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(2)所述 盐酸头孢吡肟的分子量 为553.48， 所述 羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素的分子量20 00Da； 步骤(2)所述偶联的方法为： 将羧酸 ‑聚乙二醇 ‑生物素溶解于PBS溶液中， 得10mg/mL的 羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素溶液； 将EDC和NHSS分别溶解于PBS溶液中， 得EDC溶液和 NHSS溶液， 然后将EDC溶液和 NHSS溶 液加入羧酸 ‑聚乙二醇 ‑生物素溶液中， 置于混匀仪上20～25℃活化20min； 加入盐酸头孢吡 肟， 20～25℃偶联4h； 且， 所述羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素与所述盐酸头孢吡肟的摩尔比为1∶ 1。 5.根据权利要求3或4所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(1)或 步骤(2)所述EDC和NHS S的质量比为2.90∶ 3.25 。 6.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(3)所述 共孵育的条件为180rpm下37℃孵 育25min。 7.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(4)所述 共孵育的条件为180rpm下37℃孵 育30min。 8.根据权利要求1所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征在于， 步骤(4)所述 外加磁场的磁场强度为0.4T； 具体操作为： 溶液D置于离心管中在磁力架分离3min， 用PBS溶权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115058359 A 2液洗涤并重悬， 得蜡样芽胞杆菌～头孢吡肟 ‑羧酸‑聚乙二醇 ‑生物素～链霉亲和素 ‑磁性纳 米粒子复合物。 9.根据权利要求2 ‑4和权利要求8任一所述的磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法， 其特征 在于， 所述PBS溶 液为无菌PBS溶 液， 浓度为0.01M， pH值7.4。 10.权利要求1 ‑9任一所述方法在检测食品样品中蜡样芽孢杆菌定性或定量分析中的 应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115058359 A 3