ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2457—2018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 05 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2457—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 主要设备和器械 .................................................................... 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 样品采集 .......................................................................... 2 8 细菌分离与纯化 .................................................................... 2 9 细菌鉴定 .......................................................................... 2 10 结果判定 ......................................................................... 4 11 综合判定 ......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试剂配方 ........................................................ 6 附录 B（资料性附录） 柱状黄杆菌 16S rRNA 基因参考性序列（1477bp） .................... 8 I DB51/T 2457—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：黄小丽、耿毅、陈德芳、欧阳萍、段靖、冯杨。 II DB51/T 2457—2018 斑点叉尾鮰柱形病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了由柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）引起的斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus） 柱形病的临床症状、病原鉴定方法与结果判定。 本标准适用于由柱状黄杆菌感染导致的斑点叉尾鮰柱形病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检验方法 GB/T 28630.4 白斑综合征（WSD）诊断规程 第4部分：组织病理学诊断法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.2 鱼类细菌病检疫技术规程 第2部分：柱状嗜纤维菌烂鳃病诊断方法 SC/T 7213 鮰嗜麦芽寡养单胞菌检测方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 斑点叉尾鮰柱形病 指由柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）感染引起斑点叉尾鮰（Ietalurus Punetaus）发病 或死亡的一种细菌性疾病。 4 4.1 试剂和材料 试剂、染色液与培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照GB/T 4789.28、GB/T 18652、SC/T 7014规定执行， 2+ Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg ）、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒选用专业试剂公司 提供的商品化试剂；微生物生化鉴定管可代替相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 1 DB51/T 2457—2018 4.3 引物 16SrRNA 基 因 DNA 序 列 扩 增 引 物 ， P-F ： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ， P-R ： 5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’，保存引物的使用浓度为20 μmol/L，-20℃保存。 5 主要设备和器械 超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光 学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、 铂耳丝、酒精灯等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼体色发黑，反应迟钝，靠边、游动迟缓，摄食减少或停止摄食。 6.2 体表检查 病鱼可出现不同程度烂尾、烂鳍、烂鳃、皮肤灶性腐烂或体表溃疡灶，部分可在唇部、头部等身体 多个部位出现黄色增生物。 6.3 剖检 病鱼内脏器官病变表现常不明显，偶见脾脏肿大发黑。 7 样品采集 样品采集按SC/T 7103 执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病鱼溃疡灶边缘、烂鳍烂尾处直接分离接种，常规划线接种至Shieh培养基。 或将病变鳍条或鳃丝剪下，直接放置在Shieh培养基上接种。28℃培养24h-48h，从中挑取黄色、边缘不 整齐、假根状、中央较厚的单个菌落在Shieh培养基上进行纯化培养。Shieh平板的配制方法见附录A.2。 9 细菌鉴定 9.1 革兰氏染色 按GB/T 4789.28中2.2的规定执行。菌体细长、弯曲或直的杆状，革兰氏染色阴性, 菌体大小约(4～ 8)μm×(0.5～0.7)μm。 9.2 生理生化试验 9.2.1 葡萄糖利用试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.13的规定执行，培养基变黄色为阳性。 2 DB51/T 2457—2018 9.2.2 液化明胶试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.1的规定执行，菌落周围有明显的透明圈为阳性。 9.2.3 硫酸软骨素试验 用硫酸软骨素-Shieh培养基，即含400 μg/mL的硫酸软骨素溶液和1%的牛血清白蛋白组分V的Shieh 培养基制平板（配置方法见附录A.2）, 冷却后用灭菌牙签点种供试菌株,培养48h 后在通风厨内向平板 倒入4mol/L的冰乙酸浸没培养基, 10min后菌落周围有明显的透明圈为阳性。 9.2.4 刚果红试验 配制刚果红-Shieh 培养基（配置方法见附录A.3）,用牙签点种供试菌株, 25°C 培养48h,平板上菌 落呈深红色为阳性。 9.2.5 托普霉素生长试验 配制终浓度为1μg/mL 的托普霉素-Shieh 培养基（配置方法见附录A.4），25°C 培养48h，有黄色 假根状菌落生长的判断为阳性。 9.2.6 酪素水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.2的规定执行，有酪素水解亮斑为阳性。 9.2.7 淀粉水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.3的规定执行，有明亮水解区域的为阳性。 9.2.8 七叶灵水解试验 按 SC/T 7201.2 中9.4.4的规定执行。菌落周围有黑色沉淀物为阳性。 9.2.9 氧化酶试验 按 SC/T 7213 中7.8的规定执行。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。 9.2.10 运动性 按 SC/T 7213 中7.16的规定执行。若接种细菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性 阳性；若接种细菌只生长在穿刺线上，边缘清晰，为运动性阴性。 9.3 9.3.1 16S rRNA 基因序列测定与同源性分析 细菌基因组 DNA 抽提 取2mL待检菌培养液，12000r/min离心1min，收集菌体。菌体悬浮于500μL TE缓冲液（pH8.0） （A.5）， 震荡悬浮，加入50μL 10％的SDS溶液（A.6），10μL 20mg/mL的蛋白酶K（A.7），混匀，37℃温育1h。 加入100μL 5mol/L的NaCl溶液（A.8），充分混匀，再加入100μL CTAB/NaCl溶液（A.9）混匀，65℃温 育20min。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）（A.10），混匀，12000r/min离心5min。取上清 液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.11），混匀，12000r/min离心5min。取上清液，加入1倍体 积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000r/min离心10min；沉淀用70％酒精洗涤2次，室温晾干。 加入50μL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。 3 DB51/T 2457—2018 9.3.2 16S rRNA 基因扩增 2+ PCR反应体系： 10×PCR缓冲液（无Mg ）5.0μL，MgCl2（25mmol/L）5.0μL，dNTPs（10mmol/L）1.0μL， 引物(20μmol/L)P-F和P-R各1.0μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水补足致50μL。 混匀后，3000r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板