ICS 67.050 B 23 天 DB12 津 市 地 方 标 准 DB12/T 651—2016 转基因耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种 定量检测 实时荧光 PCR 方法 Detection of genetically modified plants and derived products— Quanlitative PCR method for herbicide-resistant soybean GTS 40-3-2 and its derivates 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 651—2016 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由天津市农村工作委员会提出。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天 津市质量技术监督宝坻检测中心。 本标准主要起草人：兰青阔、宛煜嵩、杨炳存、赵新、李亮、陈锐、朱珠、刘娜、王成、徐石勇。 本标准 2016 年 9 月首次发布。 I DB12/T 651—2016 转基因耐除草剂大豆 GTS40-3-2 及其衍生品种定量检测 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂大豆 GTS 40-3-2 转化体特异性定量 PCR 检测方法的术语和定义、 检测方法、结果计算。 本标准适用于转基因耐除草剂大豆 GTS 40-3-2 及其衍生品种，以及制品中 GTS 40-3-2 转化体的 定量 PCR 检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 1485 号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部 2031 号公告—19—2013 转基因植物及其产品检测 抽样 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。 3.2 GTS 40-3-2 转化体特异性序列 event-specific sequence of GTS 40-3-2 GTS 40-3-2 外源插入片段 5′端与大豆基因组的连接区序列，包括 35S 启动子部分序列和大豆基因 组的部分序列。 4 原理 根据大豆外源基因和内标基因特异性序列设计引物和 TaqMan 荧光探针，对标准样品和试样同时 进行实时荧光 PCR 扩增。根据标准样品模板拷贝数与 Ct 值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标 基因的标准曲线。计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。 5 检测方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1.1 TaqMan 荧光 PCR 反应试剂盒。 1 DB12/T 651—2016 5.1.2 引物和探针。 5.1.2.1 Lectin 基因。 lec-1215F：5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′ lec-1332R：5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′ lec-1269P：5′-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3′ 预期扩增片段大小为 118 bp（参见附录 A）。 5.1.2.2 GTS40-3-2 转化体特异性序列。 GTS40-3-2F：5'- CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG - 3' GTS40-3-2R：5'- GACTTGTCGCCGGGAATG - 3' GTS40-3-2P：5' -CGCAACCGCCCGCAAATCC- 3' 预期扩增片段大小为 121 bp（参见附录 A）。用水分别将上述引物和探针稀释到 10 µmol/L，探针 需避光保存。 5.2 仪器 分析天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg；荧光定量 PCR 扩增仪；核酸定量仪；重蒸馏水发生器或纯水仪； 其他相关仪器设备。 5.3 分析步骤 5.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告—19—2013 规定执行。 5.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告—19—2013 规定执行。 5.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告—4—2010 规定执行。 5.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告—4—2010 规定执行。 5.3.5 标准曲线样品制备 采用相同的标准样品绘制 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标基因的标准曲线。提取 GTS40-3-2 标 准物质基因组 DNA，用 0.1×TE 或水稀释至 1×105-5×105 copies/µL（相当于 20-100 ng/µL），作为初始 模板。然后再用 0.1×TE 梯度稀释初始模板，制备不同浓度的 GTS40-3-2 标准溶液。标准溶液至少涵 盖 5 个 GTS40-3-2 浓度梯度，最低浓度拷贝数小于 200，最高浓度拷贝数大于 40000。 5.3.6 PCR 反应 5.3.6.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应，每个 PCR 反应设置 3 次平行。GTS40-3-2 转化体实时荧 光 PCR 反应按表 1 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀；Lectin 内标基因实时荧光 PCR 反应按 2 DB12/T 651—2016 表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀。将 PCR 管放在离心机上，500 g~3 000 g 离心 10 s， 然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行实时荧光 PCR 反应。反应程序为：95℃变性 2 min；进行 45 次循环扩增反应（95℃变性 15 s，60℃退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（60 ℃）时段收集荧 光信号。 表 1 GTS40-3-2 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 1× — 10 µmol/L GTS40-3-2F 0.8 µmol/L 2.0 µL 10 µmol/L GTS40-3-2R 0.8 µmol/L 2.0 µL 10 µmol/L GTS40-3-2P 0.4 µmol/L 1 .0 µL TaqMan 反应缓冲液 DNA 模板 2.0 µL 无菌水 — 总体积 25.0 µL 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。 “—”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整 水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 µL。 表 2 Lectin 内标基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1× — 10 µmol/L lec-1215F 0.2 µmol/L 0.5 µL 10 µmol/L lec-1332R 0.2 µmol/L 0.5 µL 10 µmol/L lec-1269P 0.2 µmol/L 0.5 µL DNA 模板 2 .0 µL 无菌水 — 总体积 25.0 µL 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。 “—”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整 水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 µL。 5.3.6.2 设置对照 应设置阴性对照和空白对照。以非转基因大豆材料提取的 DNA 作为 GTS40-3-2 转化体特异性检 测的阴性对照的模板；以鲑鱼精子 DNA 作为 Lectin 内标基因检测的阴性对照的模板；用纯水作为空 白对照 PCR 反应体系的模板。各对照 PCR 反应体系中，除模板外其余组分及 PCR 反应条件与 5.3.6.1.4 相同。 5.3.7 数据分析 5.3.7.1 设定阈值 实时荧光 PCR 反应结束后，以 PCR 刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声 情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间 重复性良好。 5.3.7.2 记录 Ct 值 3 DB12/T 651—2016 设定阈值后，荧光定量 PCR 仪的数据分析软件自动计算每个反应的 Ct 值，并记录。 5.3.7.3 绘制标准曲线 根据标准溶液的扩增 Ct 值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标基因的标准曲线。 标准曲线公式： 式中： y—测试样品的 Ct 值； a—标准曲线的斜率； x—模板拷贝数以 10 为底数的对数； b—标准曲线的截距。 5.3.7.4 数据可接受的标准 GTS40-3-2 阴性对照和空白对照的 GTS40-3-2 转化体 Ct 值≥38；Lectin 阴性对照和空白对照的 Lectin 内标基因 Ct 值≥38；标准曲线的 R20.98，标准曲线斜率≥ -3.6 且≤ -3.1；满足上述条件，可 以进行结果计算。否则重新进行实时荧光 PCR 扩增。 5.3.7.5 含量计算 5.3.7.5.1 计算试样模板拷贝数 将试样的 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标基因的 Ct 值分别带入 GTS40-3-2 转化体和 Lectin 内标 基因的标准曲线方程，计算 GTS40-3-2 转化体和大豆内标准基因 Lectin 的拷贝数。 计算试样模板拷贝数公式： n  10 y b a (2) 式中： n—模板拷贝数 y—测试样品的 Ct 值； a—标准曲线的斜率； b—标准曲线的截距。 5.3.7.5.2 计算试样中转基因含量 将 GTS40-3-2 转化体拷贝数和 Lectin 内标基因拷贝数带入公式（3），计算出试样中 GTS40-3-2 百 分含量。计算试样中 GTS40-3-2 转化体百分含量的公式： ×100 % (3) 式中： c—试样中 GTS40-3-2 的百分含量(%)； nGTS40-3-2—GTS40-3-2 转化体拷贝数； nLectin—大豆内标准基因 Lectin 拷贝数。 4 DB12/T 651—2016 6 结果分析与表述 6.1 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体均出现典型扩增曲线，且 Lectin 内标基因和 GTS40-3-2 转化体 的 Ct 值<36，表明样品中检出耐除草剂大豆 GTS40-3-2 转化体。表