中 华人民 共和国 公共安 全行 业 标准 GA GA/T ××××—× × × × 法庭科学 生物检材中芬太尼检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for fentanyl in biological samples—LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 ICS 13.310 A 92 GA/T × × × ×—× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、杭州市公安司法鉴定中心 。 本标准主要起草人： 董颖、王瑞花、栾玉静、 任昕昕、宋歌、 董林沛、 于忠山、何毅、王芳琳、张 蕾萍、常靖、 王炯、张云峰 、应剑波、卓晓聪、李晓飞、田国刚 。 GA/T × × × ×—× × × × 1 法庭科学 生物检材中芬太尼 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血、 尿、 肝、 肾、 胃及胃内容等 ）中芬太尼的液相色谱 -质谱 （ LC-MS） 的定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中芬太尼的定性分析和定量分析 。其他可疑样品中芬太尼的定性分 析和定量分析 可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 对生物检材进行提取、净化及浓缩， 采用液相色 谱-质谱法定性定量 ，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比作为定性判断依据； 以峰面积为 依据，采用 外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括： a） 甲醇（色谱纯） ； b） 乙腈（色谱纯） ； c） 氨水； d） 盐酸； e） 乙酸铵； f） 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据芬太尼标准物质纯度和盐型换算后，用甲醇配制 1.0mg/mL 芬太尼标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6个月。或采用市售标准溶液 ； 2） 0.1mg/mL 标准工作溶液 ：移取1.0mg/mL 标准物质溶液 1.0mL，用甲醇稀释至 10mL，混 匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3个月。实验中所用其 他浓度的混合标准工作溶 液均由 0.1mg/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到。 GA/T × × × ×—× × × × 2 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括 ： a) 具盖离心管； b) 有机系微孔滤膜： 0.22µm； c) 混合型阳离子交换 （MCX）固相萃取柱：基质为苯磺酸化的聚苯乙烯 -二乙烯苯高聚物，使用 前依次用 1mL甲醇、1mL水活化。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a） 液相色谱 -质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器； b） 电子天平； c） 离心机； d） 振荡器； e） 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g于具盖离 心管中。加入0.1m ol/L盐酸 4mL， 振荡 15min，8000 r/min离心 15min，取上清液转移至 已活化好 的MCX 固相萃取柱 中，依次 用0.1mol/L 盐酸 1mL、甲醇 1mL淋洗，弃去淋洗液， 挤干水分或离心或真空抽固 相萃取柱 2min，用1mL 5%的氨水 /甲醇溶液（体积比 5:95）进行洗脱，收集洗脱液， 置于浓缩器上 45℃ 浓缩至干，残留物用甲醇 200L溶解，用0.22μm的有机系微孔滤膜过滤， 供仪器分析。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加芬太尼标准物质 ，作为添加样品（添加样品的浓度为 10ng/mL (g)），与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱 -质谱仪（离子阱质量分析器） 条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： XTerra RP18液相色谱柱 （2.1mm× 150mm，3.5μm）或其他等效 色谱柱； 注： XTerra® RP 18是Waters公司产品的商品名称，给 出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果 其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： 65%乙腈 :35%5mmoL/L 乙酸铵（氨水调 节pH至9.5）； GA/T × × × ×—× × × × 3 c) 柱温：30℃； d) 流速： 0.2mL/min ； e) 进样量： 10µL； f) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； g) 检测方式：正离子 ； h) 毛细管电压： 4.5kV； i) 毛细管温度： 300℃； j) 雾化气流速： 35arb； k) 锥孔气流速： 5arb； l) 相对碰撞能： 32%； m) 扫描模式：采用一级、二级质谱同时全扫描 （SCAN）。 7.1.2.1.2 液相色谱 -质谱仪（三重四 极杆质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C 18柱(2.1mm× 50 mm,1.7 µm)或其他等效色谱柱； 注： ACQUITY UPLC BEH C 18是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效 产品。 b) 流动相： A:乙腈， B:5mmoL/L乙酸铵(氨水调节 pH至9)； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 1； 表1 梯度洗脱条件 时间 min A B ---- 10% 90% 1.5 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% d) 柱温：35℃； e) 流速： 0.3mL/min ； f) 进样量： 10µL； g) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； h) 检测方式：正离子 ； i) 毛细管电压： 3.0kV； j) 源温度：150℃； k) 雾化气流速： 600L/h； l) 锥孔气流速： 50L/h； m) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； n) MS参考条件（定性、定量离子 对和锥孔电压、碰撞能量 ）见表 2。 表2 MS参考条件 检测目标物 定量离子 对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 芬太尼 336.49＞187.90 336.49＞104.94 24 36 336.49＞187.90 22 GA/T × × × ×—× × × × 4 7.1.2.2 进样 分别吸取 检材、空白 和添加样品提取液 及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取绞碎的 肝脏等固体 检材样品 1.0g～2.0g各两份，按 7.1.1进行操作。 另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加芬太尼标准物质作为添加样品（添加样品中 目标物含量应为检材样品中目标物含量的 (100± 50)%） ，另一份作为空白样品，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析 。 7.2.2.2 进样 分别吸取 检材、空白和添加样品提取液 及标准工作溶 液，按 7.1.2 .1的分析条件每个样品进样分析 2～3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应 不少于6次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品 提取液平行进样 2～3次的目标物保留时间和 峰面积值，按公式（ 1）计算含量： 添样添样添样 V MAV MAW = .............................