faICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中红霉素和罗红霉素 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for erythromycin and roxithromycin in biological samples —LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC179/SC1 ）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、深圳市公安局。 本标准主要起草人： 张云峰、王芳琳、黄健、王炯、常靖、王瑞花、董颖、张蕾萍、侯小平、栾玉 静、杜鸿雁、崔冠峰、于忠山、何毅、李树辉。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中红霉素和 罗红霉素 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等） 中红霉素和 罗红霉素 的液相色 谱-质谱（ LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学生物检材中 红霉素和罗红霉素的 定性分析和定量分析。 其他可疑 样品中红霉 素和罗红霉素 的定性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行提取 、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间、 质谱特征离子 和相对丰度 比作为定性判断依据； 以峰面积为依据， 采用外标法 进行定量分析 。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。在分析中使用的试剂均为 色谱纯，试剂包括 ： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸； d) 氨水； e) 0.1%甲酸的 5mmol/L甲酸铵水溶液：称取0.315g甲酸铵加水溶解，加 1mL甲酸，用水稀释至 1000mL； f) 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 （pH值8）：称取磷酸氢二钾 5.59g与磷酸二氢钾 0.41g，用水定容至 1000mL； g) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据红霉素和罗红霉素标准物质的纯度， 各称取适量， 分别用 甲醇配制 1.0mg/mL 红霉素和罗红霉素标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6个 月。或采用市售标准溶液； GA/T× × × × —× × × × 2 2) 10.0μg/mL混合标准工作溶液：分别移取 1.0mg/ mL的红霉素和罗红霉素标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇 稀释至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 3个月。实验 中所用其 他浓度的混合标准工作 溶液均由 10.0μg/mL混合标准工作溶液 用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 有机系微孔滤膜： 0.22μm； c) 固相萃取柱 ：Oasis® HLB柱或等效固相萃取柱 ，使用前依次用甲醇 、水活化。 注： Oasis® HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平 ； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 取血液等液体 检材样品 0.5mL~ 2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品 0.5g~2.0g于具盖离心管 中，用氨水调 pH值至 9，加入 4mL乙酸乙酯，振荡 10min，8000r/min 离心 10min，分离有机相；重复提取 一次，合并两次提取的有机相，置于浓缩器上 50℃浓缩至干，残留物用 甲醇 200L溶解，用有机系微孔 滤膜过滤，作为检材样品提取液供 仪器分析。 7.1.1.2 固相萃取 取血液等液体 检材样品 0.5mL~ 2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品 0.5g~2.0g于具盖离心管 中，以4倍体积 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 稀释，振荡 10min，8000r/min 离心 20min，取上清液 转移至已活化 好的 HLB固相萃取柱中 ，控制流速为 2mL/min，依次用3mL水、 3mL甲醇 /水（体积比 1:9）溶液淋洗， 弃去淋洗液 ，挤干水分或离心或真空抽固相萃取 柱2min，用3mL甲醇洗脱， 收集洗脱液并置于浓缩器上 于50℃浓缩至干 ，用初始流动相 1mL溶解，用有机系微孔滤膜过滤，供 仪器分析。 7.1.1.3 质控样品制备 GA/T× × × × —× × × × 3 取等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白 样品可用血液替代） 两份于具盖离心管中 ，一份作 为空白样品 ，一份添加 红霉素或罗红霉素 标准物质，作为添加样品 （添加样品的浓度为 2.0ng/mL），与 检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （液相色谱-质谱） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1mm × 50mm，1.7μm)或等效色谱柱； 注： ACQUITY UPLC HSS T 3是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相： A：甲醇，B：0.1%甲酸的5mmol/L甲酸铵水溶液； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 1 ； 表1 梯度洗脱条件 时间 min A B ---- 10% 90% 1.5 40% 60% 1.8 90% 10% 2.2 90% 10% 2.5 10% 90% 4.0 10% 90% d) 柱温： 35℃； e) 进样量： 2L； f) 流速： 0.6mL/min ； g) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； h) 检测方式：正离子 ； i) 毛细管电压： 3.5kV； j) 源温度： 150℃； k) 雾化气流速： 800L/h； l) 雾化气温度： 450℃； m) 扫描模式：多反应离子监测（ MRM）； n) MS质谱参考条件 （定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量 ）见表 2。 表2 MS参考条件 目标物 定量离子对 定性离子 对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 红霉素 734.4＞158.1 734.4＞158.1 24 30 734.4＞576.4 18 罗红霉素 837.6＞158.1 837.6＞158.1 26 36 837.6＞679.5 22 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 GA/T× × × × —× × × × 4 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液 体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g两份，按 7.1.1进行操作。 内标 -工作曲线法： 另取等量相似基质的空白样品六份， 一份作为空白样品，另外五份 添加不同浓 度的标准物质 （添加浓度应呈良好的线性关系，且 检材样品中目标物的含量应在线性范围内 ），作为添 加样品，与检材样品平行操作。 内标 -单点校正法： 另取等量相似基质的空白样品 两份，一份作为空白样品，另外一份 添加标准物 质（检材样品中目标物含量应为添加样品中目标物含量的 （100±50）%），作为添加样品，与检材样品 平行操作。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液 或基质标准工作溶液 及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条 件每个样品进样分析 2～3次。若要报告测量不确定度，每个样品分