ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材 中氯霉素 检验 液相色谱 和液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examinati on methods for chloramphenicol in biological samples —HPLC and LC -MS ×××× -××-××发布 ××××-××-××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析 分技术委员会 (SAC/TC 179/SC 1)提出并归口。 本标准起草单位：北京市公安局法医检验鉴定中心 、公安部物证鉴定中心 。 本标准起草人：乔静、杨士云、袁增平、 张文芳、任昕昕、王瑞花、王芳琳、于忠山 。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中氯霉素检验 液相色谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血、 尿、 肝、 肾 、 胃及胃内容 等）中氯霉素的高效液相色谱 （ HPLC） 定量检验方法和 液相色谱 -质谱（ LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材 中氯霉素的定性 分析和定量分析 。其他可疑样品中氯霉素 的定性分 析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本 文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本 文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术 语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本 文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对 生物检材 进行提取、净化及浓缩 ，采用高效 液相色谱 法定量，液相色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和 相对丰度比作为定 性判断依据； 以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水 。除非另有说明 ，在分析中使用的试剂均为分析纯 ，试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯）； b) 乙腈（色谱纯）； c) 乙酸乙酯； d) 无水硫酸钠； e) 磷酸盐缓冲液： 称取磷酸氢二钾 （K2HPO 4· 3H 2O）17.4g，磷酸二氢钾 （KH 2PO 4）13.6g，加入 一定量的 水溶解并稀释 至1000mL，再用磷酸调 节至 pH=6.0； f) 2%乙酸 /甲醇溶液：移取乙酸 2.0mL，加入甲醇 98mL，混匀； g) 1%甲醇 /水溶液： 移取甲醇 1.0mL，加入水99mL，混匀； h) 15%甲醇 /乙腈溶液： 移取甲醇 15.0mL，加入乙腈 85mL，混匀； GA/T× × × × —× × × × 2 i) 0.06%三氟乙胺 /0.06%三乙胺 /0.25%乙腈 /水溶液：分别移 取三氟乙胺 0.6mL，三乙胺 0.6mL， 乙腈 2.5mL加水至 1000m L，混匀； j) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶 液：根据氯霉素标准物质纯度和盐型换算后 ，称取适量， 用甲醇配 制成 1.0mg/mL 的氯霉素 标准物质溶液 ，置于冰箱中冷冻保存 。有效期 6个月。或采用市 售标准溶液 ； 2) 0.1m g/mL标准工作液： 移取 1.0mg/mL 的氯霉素标准物质溶液 1.0mL于10mL容量瓶中 ， 用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3个月。实验中所用其 他浓度的单一标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 有机微孔滤膜： 0.22µm； c) 硅胶柱： 500mg； d) 固相萃取柱： Oasis® MCX或Oasis® HLB 固相萃取柱或其他等效固相萃取柱 ，使用前依次用 甲醇、水活化 。 注： Oasis® MCX 、Oasis® HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -串联质谱仪 ：配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； b) 高效液相色谱 仪：配二极管阵列检测器（ DAD）； c) 电子天平； d) 离心机； e) 振荡器； f) 移液器； g) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体 检材样品 1.0g～2.0g于具盖离 心管中，并按照以下任意一种方法操作： a) 加入乙酸乙酯 8.0mL，振荡 5min，超声 10min，8000r/min 离心 10min，分离有机相；重复提 取一次，合并两次提取的有机相，过 15.0g无水硫酸钠后，置于浓缩器上 60℃下浓缩至 干，残 留物用乙腈 1.0mL溶解，经有机系微孔滤膜过滤，供仪器分析 ； b) 加入 15%甲醇 /乙腈溶液 8.0mL，振荡 5min，8000r/min 离心 10min，分离有机相；重复提取一 次，合并两次提取的有机相， 过处理好的硅胶柱 ，收集流出液 置于浓缩器上 60℃下浓缩至干， 残留物用乙腈 1.0mL溶解，经有机系微孔滤膜过滤，供 仪器分析。 GA/T× × × × —× × × × 3 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g于具盖离 心管中。加入 pH6.0的磷酸盐缓冲液 5.0mL，混匀，超声 15min，8000r/min 离心 20min，取上清液 转移 至已活化好的 HLB或MCX固相萃取柱，控制流速为 1.0mL/min ，依次用 pH6.0的磷酸盐缓冲液 3mL、 1%甲醇 /水溶液 3mL淋洗，控制流速为 3.0mL/min ，挤干水 分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 2% 乙酸 /甲醇溶液 3mL洗脱，控制流速为 1.0mL/min ，收集洗脱液 ，洗脱液置于浓缩器上 在60℃下浓缩至 干，残留物用乙腈 1.0mL溶解，经有机微孔滤膜过滤，供仪器分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白 样品可用血液替代） 两份于具盖离心管中 ，一份作 为空白样品 ，一份添加氯霉素标准物质， 作为添加样品（ LC-MS添加样品的浓度为 0.1µg/mL(g)），与 检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 高效液相色谱条件 以下三种 参考条件均满足检测要求。每种条件 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调 整： a) 色谱参考条件一： 1) 色谱柱： XTerra MS C18色谱柱（2.1mm× 150mm ，3.5µm）或其他等效柱； 注： XTerra MS C18色谱柱为 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 柱温： 35℃； 3) 流速： 0.3mL/min ； 4) 流动相及梯度洗脱程序： 见表 1； 5) 检测波长： 280nm；参考波长： 360nm； 表1 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A （水） 流动相 B （乙腈） 1 95% 5% 8 10% 90% 10 95% 5% 15 95% 5% b) 色谱参考条件二 ： 1) 色谱柱： XTerra MS C18色谱柱（2.1mm× 50mm ，3.5µm）或其他等效柱； 注： XTerra MS C18色谱柱为 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 柱温：35℃； 3) 流速： 0.4mL/min ； 4) 流动相及梯度洗脱程序：见表 2； GA/T× × × × —× × × × 4 5) 检测波长： 280nm；参考波长： 360nm； 表2 梯度洗脱程序 时间 min 流动相 A （水） 流动相 B （甲醇） 1 80% 20% 5 10% 90% 7 80% 20% 10 80% 20% c) 色谱参考条件三 ： 1) 色谱柱： Nova-Pak® C18色谱柱（3.9mm× 150m