ICS 13.310 A 92 法庭科学 唾液中吗啡和O6-单乙酰吗啡 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for morphine and 6-acetylmorphine in saliva samples—LC-MS GA 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 ICS 13.310 A 92 GA GA/T × × × × －× × × × 中华人民共和国公安部 发布 ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 GA × × × ×—× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国 刑事技术 标准化技术委员会 毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、山东省分析测试中心 、山西医科大学 。 本标准主要起草人： 何毅、陈跃、张云峰、崔冠峰、任昕昕、 贠克明、尉志文、王芳琳、于忠山 GA × × × ×—× × × × 1 法庭科学 唾液中吗啡 和O6-单乙酰吗啡 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 唾液中吗啡和O6-单乙酰吗啡 的液相色谱 -质谱（LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 唾液中吗啡 和O6-单乙酰吗啡的定性分析和定量分析。 其他可疑样品中吗啡 和O6-单乙酰吗啡的定性分析和定量分析 可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件 。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对唾液样品进行提取、净化及浓缩，采用 液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子 和离子丰度比作为定性判断依据； 以峰面积为依据， 采用外标法或内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。在分析中使用的试剂均为 色谱纯，试剂包括： a） 乙腈； b） 甲酸； c） 甲醇； d） 氨水； e） 标准溶液： 1) 1.0mg/mL标准物质溶液：据吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质纯度和盐型换算后 ，各称取 适量，分别 用甲醇配制 1.0mg/mL 吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质溶液，置于冰箱中 冷藏 保存。有效期 6个月。或采用市售标准溶液； 2) 10.0µg/mL混合标准工作溶液：移取 1.0mg /mL的吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存 。有效期 3个月。实验 中所用其 他浓度的混合标准工作溶液均由 10.0µg/mL标准物质溶液用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 GA × × × ×—× × × × 2 5.2 材料 材料包括 ： a) 唾液采集管； b) 具盖离心管； c) 有机系微孔滤膜： 0.22µm。 6 仪器与设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配有电喷雾离子源 （ESI）和三重四极杆质量分析器 ； b) 电子天平； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品制备 7.1.1.1 蛋白沉淀 取唾液检材样品 ，以 8000r/min 离心 30min，取上清液 100μL于具盖离心管中， 加入乙腈 400μL，振荡 15min，3000r/min 离心 15min，取上清液，若采用 7.1.2.1 b) 流动相 1分析，上清液需置于浓缩器上 50℃水 浴下空气流吹干，残留物用甲醇 0.5mL溶解，用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析； 若采用 7.1.2.1 c) 流动相 2分析，上清液用有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液供仪器分析 。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量离心后的空白 唾液样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加 吗啡和 O6-单乙 酰吗啡标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为 10ng/mL） ，与检材样品平行操作，得到空白样品 提取液和添加样品提取液供 LC-MS分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （液相色谱 -质谱） 以下条件作为参考，可根据不同仪器实际 情况进行调整： a） 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C 18柱（ 2.1mm× 50mm ，1.7μm）或等效 色谱柱； 注： ACQUITY UPLC BEH C18柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b） 流动相 1：A：乙腈， B：0.1%甲酸水溶液； c） 流动相 2：A：乙腈， B：氨水溶液（pH值9）； d） 柱温：35℃； e） 流速： 0.5mL/min； f） 进样量：5μL； g） 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表 1； h） 离子源： 电喷雾电离源 （ESI）； i） 检测方式： 正离子； GA × × × ×—× × × × 3 j） 扫描方式： 多反应离子监测 （MRM）； k） 毛细管电压： 3.00kV； l） 离子源温度： 150℃； m） 脱溶剂气温度： 350℃； n） 脱溶剂气流量： 700L/h； o） 锥孔气流量： 50L/h； p） MS参考条件 （定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量等 ）见表 2。 表1 梯度洗脱条件 时间 min A B 0 10% 90% 0.50 30% 70% 1.00 90% 10% 1.50 10% 90% 3.00 10% 90% 表2 MS参考条件 名 称 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 吗啡 286.2>165.1 286.2>165.1 42 40 286.2>201.1 28 O6-单乙酰吗啡 328.2>165.1 328.2>165.1 46 34 328.2>193.0 28 238.1>207.1 14 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1 样品制备 准确移取离心后唾液样品 100μL两份，按 7.1.1进行操作 。 准确移取与检材样品等量 离心后的 空白唾液样品三份，一份作为空白样品，另两份均 添加吗啡和 O6-单乙酰吗啡 标准物质作为添加样品 （添加样品中目标物含量 应为检材样品中目标物含量的 (100± 30)%，混匀），与检材样品平行操作，得到 空白样品提取液 和添加样品提取液供仪器 分析。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液， 按7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析 2～3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 GA × × × ×—× × × × 4 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录检材样品提取液和添加样品提取液中目标物的保留时间和峰面积值，按公式 (1)计算检材样品 中目标物的含量 ： 添 样 添样 添 样 V MAVMAW= .......................................... ................................. (1) 式中： W－检材样品 中目标物的含量，单位为微克每毫升（ ng/mL）； A样－检材样品提取液 中目标物峰面积平均值； M添－添加样品中标准物添加量，单位为微克 （ng）； V样－检材样品的定容体积，单位为毫升 （mL）； A添－添加样品 提取液中目标物峰面积平均值； M样－检材样品的取样量，单位为毫升 （mL）； V添－添加样品的定容体积，单位为毫升 （mL）。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材 样品中目标物的 含量，按公式 (2)计算相对相差： %100 XXXRD2 1−= ................................ ................................ ...... (2) 式中： RD－相对相差 ，用百分比（ %）表示； X1、X2－两个检材 样品平行定量测定的含量数值； X －两个检材 样品平行定量测定含