ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T ×××× —×××× 法庭科学 生物检材 中扎来普隆、脱乙基 扎来普隆 和5-氧-扎来普隆 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination method s for zaleplon , deethylzaleplon and 5-oxy-zaleplon in biological sample s—LC-MS ×××× -××－××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1 ） 提出并归口。 本文件起草单位： 公安部物证鉴定中心 、 中国政法大学、 山西医科大学 、 德州市物证鉴定研究中心 。 本文件主要起草人： 王爱华、 张蕾萍、 徐多麒、王瑞花、 任昕昕、 邹波、孙会会、 宋歌、董林沛、 贠克明、王玉瑾 。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中扎来普隆、脱乙基扎来普隆和 5-氧-扎来普 隆检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学 领域生物检材（ 血液、尿液 ）中扎来普隆 及其代谢物脱乙基扎来普隆、 5-氧 -扎来普隆 的液相色谱 -质谱（ LC-MS）定性定量分析 方法。 本文件适用于法庭科学 领域生物检材（ 血液、尿液）中扎来普隆 和脱乙基扎来普隆、 5-氧-扎来普隆 的定性定量分析。 其他检材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行提取、净化及浓缩， 采用液相 色谱-质谱法检测，以保留时间、 质谱特征离子 对和离子对丰度比作为定性判断依据； 以峰面积为依据， 采用外标法 进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯 ， 试剂包括： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸； d) 碳酸盐缓冲液（ pH值10）：称取碳酸钠（分析纯） 2.962g，加水溶解并 稀释至100mL；称取碳 酸氢钠（分析纯） 0.840g，加水溶解并 稀释至100mL。将配好的碳酸钠和碳酸氢钠溶液按 6:4体 积比混合配制成 pH值10缓冲液； e) 0.1%甲酸水溶液：移取 0.5mL甲酸，用水稀释至500mL； f) 0.1%甲酸乙腈 溶液：移取 0.5mL甲酸，用乙腈稀释至 500mL； GA/T× × × × —× × × × 2 g) 20%甲醇水溶液（含氨水 0.5%）：移取 0.5mL氨水，加入 20mL甲醇，并用水 稀释至100mL； h) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质储备液 ：根据扎来普隆 、脱乙基扎来普隆 、5-氧-扎来普隆 标准物质 的纯度， 各称取适量， 分别用甲醇配制 1.0mg/mL 扎来普隆、 脱乙基扎来普隆、 5-氧-扎 来普隆标准物质 储备液，密封 ，-18℃以下保存，有 效期 6个月。或采用市售标准溶液； 2) 0.1mg/mL 单一标准物质工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质储备溶液， 分别用甲醇配制 成浓度为 0.1mg/mL 的单一标准工作溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 6个月。实验中 所用其他浓度的单一标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质储备溶液配制得到； 3) 0.1mg/mL 混合标准物质工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5- 氧-扎来普隆 标准物质储备溶液，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL 的混合标准物质工作溶 液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 6个月。实验中所用其他浓度的混合标准物质工作溶液 均由 1.0mg/ mL标准物质储备液配制得到 。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱： Oasis® HLB 柱或等效固相萃取柱； 注：Oasis® HLB 柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 具盖离心管； c) 具塞玻璃试管； d) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括 ： a) 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器 ； b) 电子天平 ：实际分度值 d≤0.01mg； c) 离心机； d) 振荡器； e) 浓缩器； f) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 蛋白沉淀 移取血液或尿液 检材样品 1.0mL，于具盖离心管中， 依次加入 pH值10的碳酸盐缓冲液 0.2mL和 乙腈 3.0mL，振荡 10min，不低于 8000 r/min离心 10min以上，分离有机相，经有机 系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器检测。 注：检材样品取样量 、缓冲液体积 和乙腈体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相萃取 GA/T× × × × —× × × × 3 移取血液或尿液检材样品 1.0mL， 于具盖离心管中， 加入 pH值10的磷酸缓冲液 4mL， 振荡 10min， 8000r/min 离心 10min以上， 取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中 （使用前依次用甲醇 3mL、水3mL 进行活化 ），控制上清液过柱流速为 1mL/min，用 20%甲醇水溶液（含氨水 0.5%）3mL淋洗，挤干水 分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用0.1%甲酸乙腈溶液 3mL洗脱， 控制流速为 0.5mL/min~1.0mL/min ， 收集洗脱液，经有机微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测；或将洗脱液置于浓缩 器上 50℃ 浓缩至干，残留物用 甲醇 0.2mL溶解，经有机微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器检测。 注：检材样品取样量、缓冲液体积 、洗脱溶剂体积 及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加 单一或混合 标准物 质工作溶液 ，使扎来普隆、脱乙基扎来普隆、 5-氧-扎来普隆 浓度为 30ng/mL，作为添加样品 ，与检材样 品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱 -串联质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C 18（2.1 mm× 1 50mm,1.8µ m ）或等效色谱柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C 18为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 40℃； c) 流动相： A相：0.1%甲酸水溶液；B相： 0.1%甲酸乙腈 溶液； d) 流速： 0.4mL/min； e) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1； 表1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0.1 90% 10% 0.5 90% 10% 0.51 50% 50% 1.6 50% 50% 1.7 90% 10% 4.0 90% 10% f) 扫描方式：正离子扫描 （ESI+）； g) 检测方式：多反应监测 （MRM）； h) 电喷雾电压： 5500 V； i) 离子源温度： 600℃； j) 雾化气压力： 55psi； k) 气帘气压力： 30psi； l) 辅助气压力： 50psi； m) 定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量条件见表 2。 GA/T× × × × —× × × × 4 表2 定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 扎来普隆 306.1/236.0 306.1/236.0 140 36 306.