_--_______ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T XXXX—XXXX 法庭科学 罂粟种属 SSR标记检测 毛细管 电泳荧光检测法 Forensic science –Methods for SSR detection of species identification of Papaver somniferum L. - Capillary electrophoresis and fluorescence method （报批稿） ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T XXXX—XXXX I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会（ SAC/TC 179 ）提出并归口。 本文件起草单位： 公安部物证鉴定中心、最高人民检察院检察技术信息研究中心、毕节市公安局 。 本文件主要起草人：徐小玉、 裴黎、张颖、王白石、张瑾、凃政、叶健、高珊、刘开会、彭建雄、 谢群、戈文东、倪萍娅、 宋炳轲、李元元、祝世敬。 GA/T XXXX—XXXX 1 法庭科学 罂粟种属 SSR标记检测 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了法庭科学 DNA实验室通过 PCR扩增、毛细管电泳荧光检测鉴别罂粟种属的材料准备、 操作方法和结果判定。 本文件适用于罂粟种属的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中， 注明日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GA/T 382 -2014 法庭科学 DNA实验室建设规范 GA/T 1160 -2014 常见毒品原植物的 DNA提取方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 阳性对照 positive control 在PCR系统中加入已知分型的模板 DNA进行的对照反应。 3.2 阴性对照 negative control 不含模板 DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应。 4 原理 罂粟成株在外观形态上与同属其他植物相似，难以准确区分，罂粟幼苗吗啡含量极低，无法通过 化学成分检测。 本文中的 SSR基因座具有罂粟种属特异性， 可以区分罂粟和其他植物， 每个基因座 在所 有罂粟个体中不存在扩增片段长度变化 。 5 器材 器材包括： a) 移液器； b) 台式离心机； c) 扩增仪； GA/T XXXX—XXXX 2 d) 全自动荧光分析仪。 6 试剂 试剂包括 a) 纯水； b) SSR基因座名称、核心序列及 PCR引物荧光标记见表 1： 表1 基因座核心序 列 基因座 核心序列 标记荧光 P136 GAAA FAM BP13 TCACCA FAM BP12 TTA FAM P85 TTAA HEX BP14 AAAT HEX c) PCR缓冲液； d) 热启动Taq DNA聚合酶； e) 氯化镁（MgCl 2）溶液； f) 脱氧核糖核苷三磷酸 （dNTPs）； g) 分子量内标； h) 去离子甲酰胺； i) 已知罂粟 DNA（阳性对照）。 7 实验室环境要求 符合 GA/T 382 -2014中第5章的要求。 8 操作步骤 8.1 DNA提取 准备待扩增样本并编号，检材 DNA提取方法见 GA/T 1160 -2014。 8.2 扩增反应 8.2.1 取出冷藏的扩增试剂使其温度达到室温，轻弹混匀，离心。 8.2.2 5个基因座 可逐一扩增，也可在复合扩增体系中一次性扩增。可参照表 2引物用量，配制引物 混合物。 表2 反应体系中引物 信息 基因座 反应体系中的浓度 (μmol/L) 引物参考序列 扩增片段长度 (bp) GA/T XXXX—XXXX 3 P136 0.3 F-AGAAGGAGTGTGAGATGGATGAGG R-TGACTTTCAACACCAATCTTCTCG 79 BP13 0.05 F-TCAACAACGATCAGCAGGAG R-AATCTCAGCCGTCCATGAAT 159 BP12 0.6 F-TTTTGCAGGTTTGGTTTTCA R-TATCAACCTTGGGCATTTCC 198 P85 0.05 F-GCATTTTCTTTTGTTGACGCTTCT R-TCGAGAGA AGAAGCAGAGAGGAAG 106 BP14 0.2 F-CGTGGAAATTAGGGTTTAATCG R-TTCCTGACATGCCAAGTTGA 185/197 8.2.3 选择适当的 PCR反应体系进行扩增 ，推荐10µL反应体系 。可参照表 3计算反应用量，配置 PCR 反应体系。 表3 罂粟种属 SSR标记反应体系 试剂 终浓度 2×PCR Buffer — dNTPs 0.2mmol/L MgCl 2 1.6mmol/L PCR引物 0.05-0.6μmol/L 热启动Taq DNA 聚合酶 0.3U/μL 纯水 — 模板DNA 0.5-1.0ng 8.2.4 按照计算结果混合各种成分，混匀、离心，分装到反应管内。 8.2.5 选择适当的扩增条件进行扩增。可参照表 4设置循环参数。 表4 罂粟种属 SSR标记扩增反应条件 温度(℃) 时间 循环数 95 11min 1 94 30sec 28 59 2min 72 30sec 60 60min 1 GA/T XXXX—XXXX 4 4 ∝ 1 8.2.6 将反应管放入扩增仪中，按照设定的程序运行。 8.2.7 扩增完毕后将产物置于 4℃保存。 8.3 检测分析 8.3.1 按25：1000的比例混合分子量内标和去离子甲酰胺，配制成上样混合物，振荡混合均匀。 8.3.2 向每个检测孔中加入 10μL上样混合物和 1μL扩增产物，快速离心，去除气泡。 8.3.3 详细的电泳步骤参见毛细管电泳遗传分析仪操作手册。 8.3.4 电泳完毕后，采用数据分析软件分析后得到各产物的片段长度。详细分析步骤参见分析软件操 作手册。 9 结果判断 9.1 当电泳分析结果在 5个基因座与已知罂粟阳性样本均检出相同特异性片段，则说明该检测样本 为罂粟，检验结论表述为“在 XXX等5个基因座检出罂粟特异性 DNA片段”。罂粟阳性对照检测结果 详见图1。 9.2 当电泳分析结果只有 1个基因座与阳性对照不一致时，考虑此地区罂粟在该基因座存在突变的可 能，检验结论表述为“在 XXX等4个基因座检出罂粟特异性 DNA片段”。 9.3 当电泳分析结果在 5个基因座均未检出 DNA片段（排除样本腐败原因），则说明该检测样本不是 罂粟，检验结论表述为 “在XXX等5个基因座均未检出罂粟特异性 DNA片段”。 9.4 不同条件下检测特异性片段大小可能有差异， 本文件中所列分型数据为使用 Applied Biosystems® 3500xL型遗传分析仪、 GeneScanTM 500 LizTM分子量内标、 GeneMapper®ID -X软件分析的结果（系统误差 ±0.5bp），若使用其他型号器材、试剂、软件检测，请注意随机误差与系统误差。当检测条件不同或 使用其他型号仪器时可能会出现 bp数的偏差，应以同批次检测阳性对照的结果为参考综合判断。 GA/T XXXX—XXXX 5 图1 罂粟种属鉴定阳性对照图谱 10 注意事项 10.1 DNA模板量过大，会出现非特异扩增带和片段间峰高不平衡等现象， DNA模板量应控制在 0.5ng ~1.0ng。 10.2 由于缺少等位基因分型标准物，扩增产物条带大 小由片段长度表示。 10.3 有效检测信号峰值应在 （200~10000）RFU（RFU：相对荧光单位）。当检测信号峰值超过仪器检 测最高阈值时，应重新检验。 10.4 检验鉴定中应同时检验已知罂粟样本阳性对照和扩增试剂的阴性对照。阳性对照和阴性对照均 正确时，检验结果判定才有效。 10.5 阳性对照样本使用已知罂粟提取 DNA制作而成。