ICS 13.100 CCS C 52 T/CPMA 023—202 0 血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定 液相色谱串联质谱法 Determination of N -methylcarbamoylatedhaemoglobin in blood by liquid chromatography -tandem mass spectrometry 2020-12-30发布 2021-05-01实施 中华预防医学会 发 布 团体标准 全国团体标准信息平台 T/CPMA 023—2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1- 2020给出的规则起草。 本标准由中华预防医学会提出并归口。 本标准起草单位：苏州市疾病预防控制中心、杭州医学院、江苏省疾病预防控制中心、无锡市疾病 预防控制中心、江苏康达检测技术股份有限公司。 本标准主要起草人：王春民、吴春霞、张秋萍、刘强、钱亚玲、唐红芳、阮征、刘华良、朱峰、吴 宇伉、刘文卫、付杰、李军、李建、沈强、杨海兵 全国团体标准信息平台 T/CPMA 023—2020 1 血中N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定 液相色谱串联质谱法 1 范围 本标准规定了血中N- 甲基氨甲酰血红蛋白加合物的液相色谱串联质谱检测方法。 本标准适用于接触二甲基甲酰胺的职业人群血中 N-甲基氨甲酰血红蛋白加合物的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GBZ/T 295 职业人群生物监测方法总则 3 原理 血红蛋白中的N -甲基氨甲酰血红蛋白加合物（NMHb ）经酸水解转化为 3-甲基 -5-异丙基乙内酰脲 （MVH）后，经蛋白沉淀净化，液相色谱串联质谱（ LC-MS/MS）测定，以保留时间和特征离子及其 丰度比定性，以定量特征离子的峰面积，用内标工作曲线法进行定量。 4 仪器及材料 4.1 肝素或乙二胺四乙酸（EDTA ）抗凝采血管： 5 mL。 4.2 具塞圆底离心管：15mL 。 4.3 离心机：4000 rpm 。 4.4 真空离心浓缩仪。 4.5 涡旋混合器。 4.6 电热恒温水浴锅，±2 ℃。 4.7 96孔板减压提取装置。 4.8 96孔蛋白沉淀板（配收集板及盖板）：复合吸附型（ 40mg/2ml/well ）或相当者。 4.9 天平：感量 1mg和0.1 mg。 4.10 液相色谱串联质谱仪，配电喷雾离子源。 5 试剂 5.1 超纯水。 5.2 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.3 乙腈（ C2H3N）：色谱纯。 5.4 盐酸（ HCl，ρ=1.18 g/cm³ ）：优级纯。 全国团体标准信息平台 T/CPMA 023—2020 2 5.5 冰醋酸（ CH 3COOH）：优级纯。 5.6 甲酸（ HCOOH）：色谱纯。 5.7 氯化钠（ NaCl）：分析纯。 5.8 氯化钾（KCl ）：分析纯。 5.9 十二水磷酸氢二钠（ Na2HPO 4·12H 2O）：分析纯。 5.10 磷酸二氢钾（KH 2PO 4）：分析纯。 5.11 磷酸盐缓冲溶液：称取 80 g 氯化钠、 2 g 氯化钾、 35.8 g 十二水磷酸氢二钠、 2.4 g 磷酸二氢钾 溶于 1000 mL 水中。或可直接购买成品（ PBS，10 ×）。 5.12 3-甲基- 5-异丙基乙内酰脲 （MVH ，CAS：74310- 99-9） ： 标准物质或色谱纯试剂 （纯度≥ 99.0%）。 5.13 3-甲基-异丁基海因（MIH ，CAS：675854- 31-6）：标准物质或色谱纯试剂（纯度≥ 99.0%）。 5.14 甲醇溶液（ 1:1, v /v）：量取 100 mL甲醇加入到 100 mL水中。 5.15 盐酸醋酸溶液（ 2:1,v /v）：量取 100 mL冰醋酸加入到 200 mL盐酸中。 5.16 甲酸乙腈溶液（ 1:99,v /v）：吸取 1 mL甲酸加入到 99 mL乙腈中。 5.17 MVH标准储备溶液：称取 0.0156 g MVH ，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，该储备液浓度为 2.0 mmol/L 。此溶液可在 4 ℃冰箱中保存 14 d。 5.18 MIH内标储备液：称取 0.0170 g MIH ，用甲醇溶液溶解并定容至 50 mL，该内标储备液浓度为 2.0 mmol/L 。此溶液可在 4 ℃冰箱中保存 14 d。 5.19 MIH内标工作液：临用前准确吸取 MIH内标储备液 1.0 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇溶液定 容至刻度，该内标溶液浓度为 40.0 nmol/mL 。 6 样品的采集、运输、制备和保存 6.1 样品采集、运输 按GBZ/T 295 要求采集 职业人群 静脉全血2.5 mL 于采血管中，立即轻轻摇匀； 采集未暴露于二甲基 甲酰胺的健康人群血样，立即轻轻摇匀，作为空白血样。 样品冷藏运输。 6.2 血红蛋白提取 取2 mL血样于 15 mL离心管中， 以2000 rpm 离心 15min。弃去上层， 加入 7.0 mL水，轻轻振荡 10s，立即加入 1.0 mL磷酸盐缓冲溶液， 摇匀，以1000 rpm 离心 5min。吸取上清液于另一 15 mL离心 管中，得血红蛋白提取液 。提取液在真空离心浓缩仪中（ 45 ℃）干燥至干，制成松散、无结块的血红 蛋白粉末约 300 mg。 未暴露于二甲基甲酰胺的健康人群血样，按上方法制备成空白血红蛋白。 血液中血红蛋白提取应在 24 h内完成。 6.3 样品保存 血红蛋白提取 液密封后在4 ℃可保存 3 d，在- 18 ℃可保存 5 d。干燥后血红蛋白粉末在- 18℃可保存 14 d，在-80 ℃可保存30 d 。 7 分析步骤 7.1 仪器操作参考条件 全国团体标准信息平台 T/CPMA 023—2020 3 7.1.1 液相色谱参考条件 a) 色谱柱： Bonshell C 18 Plus（3.0mm ×50mm，2.7µ m，100 Å）或相当者； b) 柱温： 35℃； c) 流动相： A为0.1%甲酸溶液，B 为0.1%甲酸乙腈溶液； d) 流速： 0.25mL/min； e) 进样量：5 µL； f) 流动相梯度洗脱条件见表 1。 表1 流动相梯度洗脱条件 时间/ min 流动相 A/% 流动相 B/% 0.00 90 10 1.20 10 90 3.00 10 90 3.50 90 10 4.00 90 10 7.1.2 质谱参考条件 a) 电离方式：电喷雾电离（ ESI），正离子模式； b) 毛细管电压：3.5 kV ； c) 源温度：150 ℃； d) 脱溶剂气温度： 350 ℃； e) 脱溶剂气流速： 800 L/h； f) 检测方式：多反应监测（ MRM），监测参数见表 2。 表2 多反应监测（MRM ）参数 化合物 母离子 子离子 锥孔电压/ V 碰撞能量/ V 3-甲基-5 -异丙基乙内 酰脲 157.1 72.0а 32 15 129.1 32 11 3-甲基-异丁基海因 171.1 86.0а 30 15 a 为定量离子 7.2 工作曲线制备 与测定 各取适量 MVH标准储备溶液，用甲醇溶液将其稀释成 0 nmol/mL ~400 nmol/mL 的标准系列 溶液。 依次取 100µL以上标准系列溶液 ，加入到各含有 0.100 g空白血红蛋白粉末的 15mL圆底离心管中，然 后各加入 250µL MIH内标工作液 ，再各加入盐酸醋酸溶液 4.65mL，立即涡旋混匀 30s，将以上离心管 置于 95 ℃水浴中加热降解 1 h，取出冷却至室温，混匀后净化。 取降解后溶液 200µL上样到 96孔蛋白沉淀板，加入 600µ L甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制 真空泵压力使液滴流出速度不超过 1 mL/ min，收集流出液，混匀； 制备得到内标 MIH含量为 10.0 nmol 的MVH含量为 0 nmol~40 nmol 标准工作系列溶液。 全国团体标准信息平台 T/CPMA 023—2020 4 参照仪器操作条件，分别测定标准工作系列溶液 ；以标准 工作系列溶液中 MVH的含量为横坐标， 以测得的 MVH峰面积与内标 MIH峰面积比值为纵坐标，绘制内标工作曲线。 7.3 样品处理 称取0.1g（精确至 0.001g） 血红蛋白粉末置于 15mL具塞圆底离心管中， 加入 250 µL MIH内标工作液， 再加入盐酸醋酸溶液 4.75mL，立即涡旋混匀30s 。将离心管置于 95 ℃水浴中加热降解 1 h，取出冷却至室 温，混匀后待净化。 注：降解反应过程可能产生气泡，小心操作。 取降解后溶液200 µL上样到96孔蛋白沉淀板，加入600 µL甲酸乙腈溶液，混匀后盖上盖板。控制真 空泵压力使液滴流出速度不超过 1 mL/ min，收集流出液，混匀后待测。 7.4 样品测定 用测定标准系列溶液的操作条件测定样品和样品空白溶液。 样品中待测组分保留时间与标准工作溶 液中对应