ICS 65. 020. 20 B 16 DB61 陕 長西 省地 國方标准 DB 61/T 1369—2020 DB 61/T 1369—2020 弥猴桃细菌性溃疡病早期监测技术规范 Guideline for early surveillance of Pseudomonas syringae pv. actinidiae of Kiwifruit 地方标准信息服务平台 2020-09-15发布 2020-10-15实施 陕西省市场监督管理局 发布 DB61/T 1369—2020 目 次 前言 范围 规范性引用文件 3 符号代号和缩略语. 原理 5 监测时期 6 检测方法.. 7 结果判定， 8 检测样品与菌株保存 结果记录与资料保存 附录A（规范性附录） 猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)相关资料 附录B（规范性附录） 猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)的菌落PCR检测方法 附录C（规范性附录） 猕猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)LAMP检测方法. 地方标准 DB61/T 1369—2020 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由西北农林科技大学提出。 本标准由陕西省农业农村厅归口。 本标准起草单位：西北农林科技大学， 陕西省植物保护工作总站 本标准主要起草人：黄丽丽、徐亮胜、王娜娜、高小宁、冯浩、范东晟。 本标准由西北农林科技大学负责解释。 本标准首次发布。 联系信息如下： 单位：西北农林科技大学 电话：029—87091312 地址：陕西省杨凌区邰成路西北农林科技大学 邮编：712100 地方标准 II DB61/T1369—2020 猕猴桃细菌性溃疡病早期监测技术规范 1范围 本标准规定了猕猴桃细菌性溃疡病监测技术的原理、监测时期、检测方法、结果判定、检测样品与 菌株保存、结果记录与资料保存的要求和内容。 本标准适用于以常规生物学鉴定方法、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermalamplification， LAMP）和菌落PCR检测方法两种分子检测技术为基础，对猕猴桃细菌性溃疡病进行早期监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法。 GB/T23621—2009农业植物检疫实验室基础条件 3 ：符号代号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 英文缩略语 中文翻译 英文全称 LAMP 环介导恒温扩增 Loop-mediated isothermal amplification Betaine 甜菜碱 Bst 酶 BstDNA聚合酶（大片段） Bst DNA polymerase (large fragment) dNTP 脱氧核糖苷三磷酸 deoxyribonucleosidetriphosphate 标准 4原理 猕猴桃溃疡病菌可侵染叶片、枝条、花朵和果实等组织，并在其中存活和繁殖扩展。带菌植株早期 从外观上和健康植株无明显差异，难以识别。本标准利用常规生物学鉴定方法、菌落PCR检测方法和环 介导等温扩增技术进行检测，为早期监测和预防猕猴桃细菌性溃疡病提供技术支撑， 5监测时期 苗木定植、接穗采集、嫁接、田间授粉、修剪等农事活动前后分别进行1次检测监测。 6检测方法 6.1实验室要求 猕猴桃细菌性溃疡病菌检测所用实验室的设置与管理符合GB/T23621—2009要求 1 DB61/T1369—2020 6.2采样 按照五点式取样法或1%繁殖材料样本量取样，采集待检测猕猴桃叶片、枝条、花朵或果实。 6.3待检材料保存 样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。 6.4方法 6.4.1检测方法 包括分离物菌落形态和基因组特异序列PCR扩增，LAMP检测技术等方法的观察结果进行鉴定。 6.4.2常规生物学观察 采用常规组织分离法，将采集的样品，用无菌的手术刀切取部分组织，用70%酒精或0.6%的次 氯酸钠（NaClO）表面消毒处理3min～5min，再用无菌水冲洗3次。将病变组织悬浮于少量无菌水中， 用无菌玻璃棒挤压，使组织中的细菌流入水中形成悬浮液。轻轻混匀后用接种环蘸取悬浮液，在选择性 培养基（KBA+萘啶酮酸（终浓度为10μg/mL））上划线分离，封皿后25℃恒温培养2d～3d，筛选疑 似菌落进行划线纯化，观察菌落形态和病原菌形态特征。猕猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征见 附录A第A.6章，根据菌落特征选取可疑菌落做进一步PCR鉴定。 6.4.3菌落PCR检测方法 用已知的猕猴桃溃疡病菌标准菌株（M228）作为阳性对照，丁香假单胞杆菌番茄致病变种或等效 标准菌株作为阴性对照，灭菌双蒸水作为空白对照进行PCR检测，PCR检测方法和操作流程见附录B。 6.4.4LAMP检测技术 操作流程详见附录C。 地方标准 7结果判定 7.1常规实验结果判定 通过常规实验观察，分离培养放置6d以上。如发现疑似细菌菌落，做进一步PCR鉴定。若PCR检测 结果为阳性，且扩增产物片断大小与描述相符（即扩增产物大小为310bp），可以判定为待测样品中携 带有猕猴桃细菌性溃疡病；否则为阴性。 7.2LAMP结果判定 通过LAMP检测的，若检测结果为阳性（即待检样品反应管液体呈绿色），可以判定为检出猕猴桃 溃疡病菌，否则为阴性。 8检测样品与菌株保存 备份样品及从样品中分离到并鉴定为猕猴桃溃疡病菌的菌株，应妥善保存。备份样品可置于4℃冰 箱保存，菌株可接种于KBA培养基斜面上，25℃恒温培养2d～3d后置于4℃冰箱保存，或加入10%体 积的甘油制成甘油菌液，置于-80℃冰箱长期保存 2